从检验学角度探讨人体皮肤菌群(2)
1皮肤微生物检测技术
微生物检测技术是获得微生物特征信息的手段，从传统的培养技术到最新的高通量测序平台的建立，实现了对细菌有限数量到细菌微环境的检测。细菌检测方法正得到不断的发展和更新，以往因技术欠缺所导致微观领域认识不足等问题得到改观。检测方法的选择要根据检测目的、原理、成本及操作等多方面条件考虑进行选择。
1.1传统医学实验室检测 以往的医学临床实验室细菌检测多采用培养学方法，即用人工方法将采集的标本接种于营养培养基上，提供细菌生长所必须的外界条件：适宜温度、湿度、气体环境等，符合特定条件的细菌则能生长繁殖。该方法检测成本低，检测周期较长，一些生长条件要求苛刻的细菌很难在常规条件下培养出来。有报道称，皮肤上近99%的细菌是不能在普通培养基上培养出来的[5]。这类培养的鉴定过程是通过细菌形态和生化反应等表型鉴定方法进行的，相比于分子生物学方法，后者的鉴定结果更为可靠。
1.2 DNA测序技术 在原核微生物中，16S rRNA基因是编码16 rRNA相對应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，在结构和功能上16S rRNA具有高度的保守性和特异性，还具有“种”间多态区[6]，因此，分析其序列可确定各种细菌的进化距离和相互关系。目前，已有上千种细菌的16S rDNA序列被测定，并载入基因库。测序技术能够克服传统鉴定过程中生化反应的多种局限性，对疑难细菌的鉴定尤为重要。测序技术目前已经发展到第二代，又称新一代测序技术，相比于第一代的优点是能够快速、低成本地处理几百万基因序列信息，这种单次运行处理海量序列数据的能力是它的突出特点，故又称为高通量测序技术[7]。目前使用最为广泛的3种主流测序技术有Roche/454焦磷酸测序仪、Genome Analyzer(Illumina GA)测序仪和Biosystems SOLiD基因测序仪，在基因组学中具有里程碑意义。
, 百拇医药
1.3质谱技术 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)是将样品(细菌、真菌)混入基质分子中使其形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，样品电离后在电场作用下飞过真空的飞行管，通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。离子质量电荷之比(M/Z)为横坐标，飞行时间检测器探测到的离子峰为纵坐标，绘制质谱图，经软件与质谱数据库进行比较，根据特异图谱实现对目标微生物属、种及亚型的区分和鉴定[8]。该技术可将完整病原菌细胞直接检测，但是为降低细菌样本复杂性，需要对检测样本进行增殖或富集处理。该方法鉴定过程仅用10 min甚至更短时间，耗材成本较传统鉴定法低3～5倍[9]。菌库大，对常规条件下难鉴定的细菌有较好的鉴定效果。
2正常皮肤菌群
人类皮肤细菌可分为两大类：①常居菌(Resident microorganisms)：也称固有性细菌，是人体表面数量及种类较固定的微生物群体。在皮肤环境变化菌群受到干扰的情况下，能够重新建立原有菌群构成。Grice EA等从健康成人20个不同皮肤位置进行采样，采取高通量测序手段发现常居菌主要分为四门：放线菌门(52%)、厚壁菌门(24%)、变形菌门(17%)和拟杆菌门(7%)[10]。主要包括：表皮葡萄球菌、需氧性孢子菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕孢子菌属、类白喉杆菌属等。②暂居菌(Transient microorganisms)：来自于外部环境，寄居在皮肤表面几个小时到几天后消失，不建立永久定植，这类细菌有革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、八叠球菌、链球菌属等，还包括变形杆菌及肠杆菌科大肠杆菌及粪产检杆菌等。宿主正常的卫生状况、免疫状态、完好的皮肤屏障功能等正常状态下，常居菌和暂居菌是不会致病的。然而，多重因素影响宿主的正常状态时，这两类细菌都有可能成为致病菌，增殖并引发疾病的发生。例如，表皮葡萄球菌是皮肤常居菌，在免疫力低下的患者中可能引发机会性致病。此外，一般情况下，金黄色葡萄球菌为暂居菌，在部分人群中金葡菌可成为无症状带菌者的常驻微生物，同时也是重要的病原体[11]。
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3影响皮肤菌群分布的因素
皮肤构造的影响及分泌的化学物质不同，导致不同个体皮肤微环境存在差异，这是皮肤菌群分布的主要影响因素。皮肤的解剖构造，如皮沟、皮嵴等为细菌提供了一个独特的微生态栖息场所。皮脂腺、汗腺、毛囊等皮肤附属结构的特殊凹陷及功能为细菌生长提供不同的物质及环境条件。人类皮肤根据性质不同，分为皮脂溢出部位、潮湿部位和干燥部位，这是影响皮肤菌群的一类重要因素。高通量测序显示不同性质皮肤表面细菌分布的种类差异很大，如正常人潮湿部位多定植革兰氏阳性的葡萄球菌、微球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌等[12]。皮脂分泌旺盛部位为适合厌氧环境的亲脂性丙酸杆菌和亲脂性真菌马拉色菌占优势[13]。干燥部位定植的细菌较为丰富，以葡萄球菌、丙酸杆菌、微球菌、棒状杆菌、链球菌多见[14]。另外，影响皮肤菌群分布的其他因素有：地理因素导致的紫外线差异、气候、气温，过量饮酒导致营养和维生素缺乏降低机体免疫力和皮肤屏障功能，个人卫生习惯和护肤品的选择以及同一个体不同pH值及温度等[15]。
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细菌与细菌之间存在复杂的抑制、促进的关系，这种关系在菌群多样性的产生和维持中发挥着重要的作用。抑制是通过竞争及拮抗作用来实现。微生物拮抗作用是指一种微生物在其生命活动中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其它微生物的生长繁殖，甚至杀死其它微生物的现象。常驻菌群能够降低皮肤酸碱度，维持皮肤酸性环境为pH 3～5，以此抑制病原微生物的入侵和繁殖[5]，如痤疮丙酸杆菌在某种程度上通过分解皮脂脂质释放脂肪酸，脂肪酸所产生的酸性环境不利于金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的繁殖，还能抑制耐甲氧西球菌和棒状杆菌的生长，一定程度上抑制了致病菌的生长。表皮葡萄球菌则通过引起脂质膜渗漏和促进宿主产生抗菌肽(AMPs)等机制抑制致病菌的生长[16]。丙酸杆菌和表葡作为正常菌群共同对致病菌起到抑制作用，在一定程度上控制了致病菌数量，这两种正常菌之间为促进关系。, 百拇医药(丽敏 宋佳春 王虎明)
微生物检测技术是获得微生物特征信息的手段，从传统的培养技术到最新的高通量测序平台的建立，实现了对细菌有限数量到细菌微环境的检测。细菌检测方法正得到不断的发展和更新，以往因技术欠缺所导致微观领域认识不足等问题得到改观。检测方法的选择要根据检测目的、原理、成本及操作等多方面条件考虑进行选择。
1.1传统医学实验室检测 以往的医学临床实验室细菌检测多采用培养学方法，即用人工方法将采集的标本接种于营养培养基上，提供细菌生长所必须的外界条件：适宜温度、湿度、气体环境等，符合特定条件的细菌则能生长繁殖。该方法检测成本低，检测周期较长，一些生长条件要求苛刻的细菌很难在常规条件下培养出来。有报道称，皮肤上近99%的细菌是不能在普通培养基上培养出来的[5]。这类培养的鉴定过程是通过细菌形态和生化反应等表型鉴定方法进行的，相比于分子生物学方法，后者的鉴定结果更为可靠。
1.2 DNA测序技术 在原核微生物中，16S rRNA基因是编码16 rRNA相對应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，在结构和功能上16S rRNA具有高度的保守性和特异性，还具有“种”间多态区[6]，因此，分析其序列可确定各种细菌的进化距离和相互关系。目前，已有上千种细菌的16S rDNA序列被测定，并载入基因库。测序技术能够克服传统鉴定过程中生化反应的多种局限性，对疑难细菌的鉴定尤为重要。测序技术目前已经发展到第二代，又称新一代测序技术，相比于第一代的优点是能够快速、低成本地处理几百万基因序列信息，这种单次运行处理海量序列数据的能力是它的突出特点，故又称为高通量测序技术[7]。目前使用最为广泛的3种主流测序技术有Roche/454焦磷酸测序仪、Genome Analyzer(Illumina GA)测序仪和Biosystems SOLiD基因测序仪，在基因组学中具有里程碑意义。
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1.3质谱技术 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)是将样品(细菌、真菌)混入基质分子中使其形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，样品电离后在电场作用下飞过真空的飞行管，通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。离子质量电荷之比(M/Z)为横坐标，飞行时间检测器探测到的离子峰为纵坐标，绘制质谱图，经软件与质谱数据库进行比较，根据特异图谱实现对目标微生物属、种及亚型的区分和鉴定[8]。该技术可将完整病原菌细胞直接检测，但是为降低细菌样本复杂性，需要对检测样本进行增殖或富集处理。该方法鉴定过程仅用10 min甚至更短时间，耗材成本较传统鉴定法低3～5倍[9]。菌库大，对常规条件下难鉴定的细菌有较好的鉴定效果。
2正常皮肤菌群
人类皮肤细菌可分为两大类：①常居菌(Resident microorganisms)：也称固有性细菌，是人体表面数量及种类较固定的微生物群体。在皮肤环境变化菌群受到干扰的情况下，能够重新建立原有菌群构成。Grice EA等从健康成人20个不同皮肤位置进行采样，采取高通量测序手段发现常居菌主要分为四门：放线菌门(52%)、厚壁菌门(24%)、变形菌门(17%)和拟杆菌门(7%)[10]。主要包括：表皮葡萄球菌、需氧性孢子菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕孢子菌属、类白喉杆菌属等。②暂居菌(Transient microorganisms)：来自于外部环境，寄居在皮肤表面几个小时到几天后消失，不建立永久定植，这类细菌有革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、八叠球菌、链球菌属等，还包括变形杆菌及肠杆菌科大肠杆菌及粪产检杆菌等。宿主正常的卫生状况、免疫状态、完好的皮肤屏障功能等正常状态下，常居菌和暂居菌是不会致病的。然而，多重因素影响宿主的正常状态时，这两类细菌都有可能成为致病菌，增殖并引发疾病的发生。例如，表皮葡萄球菌是皮肤常居菌，在免疫力低下的患者中可能引发机会性致病。此外，一般情况下，金黄色葡萄球菌为暂居菌，在部分人群中金葡菌可成为无症状带菌者的常驻微生物，同时也是重要的病原体[11]。
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3影响皮肤菌群分布的因素
皮肤构造的影响及分泌的化学物质不同，导致不同个体皮肤微环境存在差异，这是皮肤菌群分布的主要影响因素。皮肤的解剖构造，如皮沟、皮嵴等为细菌提供了一个独特的微生态栖息场所。皮脂腺、汗腺、毛囊等皮肤附属结构的特殊凹陷及功能为细菌生长提供不同的物质及环境条件。人类皮肤根据性质不同，分为皮脂溢出部位、潮湿部位和干燥部位，这是影响皮肤菌群的一类重要因素。高通量测序显示不同性质皮肤表面细菌分布的种类差异很大，如正常人潮湿部位多定植革兰氏阳性的葡萄球菌、微球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌等[12]。皮脂分泌旺盛部位为适合厌氧环境的亲脂性丙酸杆菌和亲脂性真菌马拉色菌占优势[13]。干燥部位定植的细菌较为丰富，以葡萄球菌、丙酸杆菌、微球菌、棒状杆菌、链球菌多见[14]。另外，影响皮肤菌群分布的其他因素有：地理因素导致的紫外线差异、气候、气温，过量饮酒导致营养和维生素缺乏降低机体免疫力和皮肤屏障功能，个人卫生习惯和护肤品的选择以及同一个体不同pH值及温度等[15]。
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细菌与细菌之间存在复杂的抑制、促进的关系，这种关系在菌群多样性的产生和维持中发挥着重要的作用。抑制是通过竞争及拮抗作用来实现。微生物拮抗作用是指一种微生物在其生命活动中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其它微生物的生长繁殖，甚至杀死其它微生物的现象。常驻菌群能够降低皮肤酸碱度，维持皮肤酸性环境为pH 3～5，以此抑制病原微生物的入侵和繁殖[5]，如痤疮丙酸杆菌在某种程度上通过分解皮脂脂质释放脂肪酸，脂肪酸所产生的酸性环境不利于金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的繁殖，还能抑制耐甲氧西球菌和棒状杆菌的生长，一定程度上抑制了致病菌的生长。表皮葡萄球菌则通过引起脂质膜渗漏和促进宿主产生抗菌肽(AMPs)等机制抑制致病菌的生长[16]。丙酸杆菌和表葡作为正常菌群共同对致病菌起到抑制作用，在一定程度上控制了致病菌数量，这两种正常菌之间为促进关系。, 百拇医药(丽敏 宋佳春 王虎明)