结核分枝杆菌Rv1626的原核表达及其免疫功能研究(2)
Key words：Mycobacterium tuberculosis;Rv1626;Prokaryotic expression;Immunogenicity;Tuberculosis
结核病(TB)由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引发，与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、疟疾(malaria)并称为世界上三大主要的传染性疾病。全球约有1/4人群感染M.tb，2016年全球TB新发病例约为1040万，其中金砖五国占其总数的50%以上，中国的TB发病率和死亡率均在22个TB高负担的国家位居前列[1]。尽管卡介苗(BCG)在全球接种覆盖率超过90%，但对接种者的保护效应仅能持续约5～10年，这可能是由于世界各地BCG培养和免疫策略不同，进而导致基因型的改变[2]。由于BCG无法对成人TB提供足够的免疫保护力，尤其对M.tb潜伏感染人群(LTBI)效果有限，故亟需更高效的结核病预防和治疗性疫苗。本课题基于筛选和构建M.tb感染分泌期高表达抗原Rv1626，以体外人群和体内动物实验检测其免疫原性，旨在为新型结核疫苗的研究提供有效的候选靶抗原。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1实验材料 E.coli DH5α株、E.coli BL21(DE3)株购自Tiangen生物公司;SPF级C57BL/6小鼠购自安徽医科大学实验动物中心;Ni-NTA 蛋白纯化系统购自GE公司;人、鼠相关细胞因子ELISA kit检测试剂盒均购自深圳Dakewe公司。二甲基三十六烷基铵(DDA)、单磷酰脂质A(MPL)和海藻糖6，6'-二分枝菌酸(TDB)购自Sigma公司。
1.2方法
1.2.1引物设计 分析pPROEX载体上的多克隆位点及Rv1626全序列酶切位点，设计特异性引物(P1： TTCGGATCC ACCGGCCCCACCACCGACG，P2： ATCTCGAG GGTGTCTTTGGGTGTTCCGAGGGTT)。PCR扩增条件：95 ℃，5 min，94 ℃，50 s，65 ℃，50 s，72 ℃，40 s，30 cycles，72 ℃，10 min。
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1.2.2质粒构建表达、纯化 以分子克隆法将Rv1626基因片段导入原核表达载体pPROEX中，构建重组载体pPRO-Rv1626，以BamHⅠ和XhoⅠ行双酶切鉴定。过夜培养后，经CaCl2和热休克法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达，再以Ni-NTA纯化蛋白，4 ℃梯度透析36 h后以内毒素清除试剂盒除去内毒素(<0.1 EU/ml)。以15% SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定蛋白，再以BCA试剂盒测定蛋白浓度。
1.2.3 IGRA检测不同人群外周血抗原特异性IFN-γ水平 委托山西长治医院检验科，病史采集、问卷调查及全身体检，随机选取感染者和健康者共40例，同时依据临床诊断标准对受试人群进行初筛。感染者(包括ATB和LTBIs)：存在(或无)明显TB感染症状、有与TB患者接触史、痰涂片或痰培养阳性(或阴性)、胸部X光出现可疑阴影(或正常)，以及结核菌素试验(TST)检测阳性(TST≥5 mm);健康对照者：无与TB感染者密切接触史、TST检测阴性(TST<5 mm)。
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采集受试者的全血，以0.5 ml/孔加入无菌24孔板，并以5 μg/孔rRv1626蛋白进行刺激，置37 ℃温箱孵24 h。同时分别以等体积的PBS和PHA分别为阴性和阳性对照，收集血浆以人IFN-γ ELISA试剂盒检测各孔IFN-γ浓度，并得出各孔最终值=实际测得值-PBS刺激的本底值。
1.2.4实验动物分组及免疫方式 6周龄雌性C57BL/6小鼠共30只，分为PBS组、BCG組、佐剂DMT(DDA、TDB、MPL)组、Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组，6只/组。具体免疫方式如下：①PBS组：200 μl PBS /只;②BCG组：200 μl /只(含菌1.2×106 CFU)BCG免疫1次;③DMT组：100 μl DMT混合100 μl PBS /只;④Rv1626/DMT组：含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只;⑤BCG+Rv1626/DMT组：先以200 μl/只(含菌1.2×106 CFU)BCG免疫1次，3周后以Rv1626/DMT(含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只)增强免疫2次，间隔3周。注射方式：PBS组和BCG组分别为0周注射1次;DMT和Rv1626/DMT组免疫共3次，每3周注射1次;BCG+Rv1626/DMT组0周时先以BCG注射1次，3周后，以Rv1626/DMT增强2次，每3周1次。
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1.2.5小鼠血清中抗原性特异性抗体水平检测 免疫9周后，对各组小鼠摘眶取血，收集各组小鼠血清，应用间接ELISA法检测抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a滴度(以阳性结果最高稀释倍数的倒数表示)，以IgG2a和IgG1实际测得的稀释倍数计算IgG2a：IgG1。
1.2.6 ELISA检测脾细胞培养上清中抗原特异性IFN-γ、TNF-α和IL-2 水平 无菌分离出小鼠脾细胞并定量，将100μl的2.5×106 /孔的脾细胞加入24孔板中，阳性对照组为PPD(10μg /孔);阴性对照组为RPMI1640培养基;实验组为Rv1626蛋白(10μg /孔)。37 ℃培养24～72 h后，离心并收集上清，用鼠ELISA试剂盒检测相应细胞因子分泌水平。
1.3统计学分析 以SPSS18.0进行数据分析，IGRA法检测不同人群IFN-γ浓度水平，采用非参数U检验，各组小鼠免疫原性相关指标比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义，P<0.001为统计学意义极显著。, 百拇医药(袁伟 许礼发 王晓春 张京燕 朱心怡)
结核病(TB)由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引发，与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、疟疾(malaria)并称为世界上三大主要的传染性疾病。全球约有1/4人群感染M.tb，2016年全球TB新发病例约为1040万，其中金砖五国占其总数的50%以上，中国的TB发病率和死亡率均在22个TB高负担的国家位居前列[1]。尽管卡介苗(BCG)在全球接种覆盖率超过90%，但对接种者的保护效应仅能持续约5～10年，这可能是由于世界各地BCG培养和免疫策略不同，进而导致基因型的改变[2]。由于BCG无法对成人TB提供足够的免疫保护力，尤其对M.tb潜伏感染人群(LTBI)效果有限，故亟需更高效的结核病预防和治疗性疫苗。本课题基于筛选和构建M.tb感染分泌期高表达抗原Rv1626，以体外人群和体内动物实验检测其免疫原性，旨在为新型结核疫苗的研究提供有效的候选靶抗原。
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1 材料与方法
1.1实验材料 E.coli DH5α株、E.coli BL21(DE3)株购自Tiangen生物公司;SPF级C57BL/6小鼠购自安徽医科大学实验动物中心;Ni-NTA 蛋白纯化系统购自GE公司;人、鼠相关细胞因子ELISA kit检测试剂盒均购自深圳Dakewe公司。二甲基三十六烷基铵(DDA)、单磷酰脂质A(MPL)和海藻糖6，6'-二分枝菌酸(TDB)购自Sigma公司。
1.2方法
1.2.1引物设计 分析pPROEX载体上的多克隆位点及Rv1626全序列酶切位点，设计特异性引物(P1： TTCGGATCC ACCGGCCCCACCACCGACG，P2： ATCTCGAG GGTGTCTTTGGGTGTTCCGAGGGTT)。PCR扩增条件：95 ℃，5 min，94 ℃，50 s，65 ℃，50 s，72 ℃，40 s，30 cycles，72 ℃，10 min。
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1.2.2质粒构建表达、纯化 以分子克隆法将Rv1626基因片段导入原核表达载体pPROEX中，构建重组载体pPRO-Rv1626，以BamHⅠ和XhoⅠ行双酶切鉴定。过夜培养后，经CaCl2和热休克法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达，再以Ni-NTA纯化蛋白，4 ℃梯度透析36 h后以内毒素清除试剂盒除去内毒素(<0.1 EU/ml)。以15% SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定蛋白，再以BCA试剂盒测定蛋白浓度。
1.2.3 IGRA检测不同人群外周血抗原特异性IFN-γ水平 委托山西长治医院检验科，病史采集、问卷调查及全身体检，随机选取感染者和健康者共40例，同时依据临床诊断标准对受试人群进行初筛。感染者(包括ATB和LTBIs)：存在(或无)明显TB感染症状、有与TB患者接触史、痰涂片或痰培养阳性(或阴性)、胸部X光出现可疑阴影(或正常)，以及结核菌素试验(TST)检测阳性(TST≥5 mm);健康对照者：无与TB感染者密切接触史、TST检测阴性(TST<5 mm)。
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采集受试者的全血，以0.5 ml/孔加入无菌24孔板，并以5 μg/孔rRv1626蛋白进行刺激，置37 ℃温箱孵24 h。同时分别以等体积的PBS和PHA分别为阴性和阳性对照，收集血浆以人IFN-γ ELISA试剂盒检测各孔IFN-γ浓度，并得出各孔最终值=实际测得值-PBS刺激的本底值。
1.2.4实验动物分组及免疫方式 6周龄雌性C57BL/6小鼠共30只，分为PBS组、BCG組、佐剂DMT(DDA、TDB、MPL)组、Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组，6只/组。具体免疫方式如下：①PBS组：200 μl PBS /只;②BCG组：200 μl /只(含菌1.2×106 CFU)BCG免疫1次;③DMT组：100 μl DMT混合100 μl PBS /只;④Rv1626/DMT组：含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只;⑤BCG+Rv1626/DMT组：先以200 μl/只(含菌1.2×106 CFU)BCG免疫1次，3周后以Rv1626/DMT(含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只)增强免疫2次，间隔3周。注射方式：PBS组和BCG组分别为0周注射1次;DMT和Rv1626/DMT组免疫共3次，每3周注射1次;BCG+Rv1626/DMT组0周时先以BCG注射1次，3周后，以Rv1626/DMT增强2次，每3周1次。
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1.2.5小鼠血清中抗原性特异性抗体水平检测 免疫9周后，对各组小鼠摘眶取血，收集各组小鼠血清，应用间接ELISA法检测抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a滴度(以阳性结果最高稀释倍数的倒数表示)，以IgG2a和IgG1实际测得的稀释倍数计算IgG2a：IgG1。
1.2.6 ELISA检测脾细胞培养上清中抗原特异性IFN-γ、TNF-α和IL-2 水平 无菌分离出小鼠脾细胞并定量，将100μl的2.5×106 /孔的脾细胞加入24孔板中，阳性对照组为PPD(10μg /孔);阴性对照组为RPMI1640培养基;实验组为Rv1626蛋白(10μg /孔)。37 ℃培养24～72 h后，离心并收集上清，用鼠ELISA试剂盒检测相应细胞因子分泌水平。
1.3统计学分析 以SPSS18.0进行数据分析，IGRA法检测不同人群IFN-γ浓度水平，采用非参数U检验，各组小鼠免疫原性相关指标比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义，P<0.001为统计学意义极显著。, 百拇医药(袁伟 许礼发 王晓春 张京燕 朱心怡)