结核分枝杆菌Rv1626的原核表达及其免疫功能研究(3)
2 结果
2.1 pPROEX-Rv1626原核表达载体的构建、表达纯化和免疫印迹分析 经PCR扩增出大小为612 bp的序列片段，插入pPROEX后，成功构建重组质粒pPROEX-Rv1626。经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切及测序鉴定无误(见图1A、B)。rRv1626蛋白诱导表达并经Ni-NTA柱以变性条件纯化后，获得分子量为22.4 kD蛋白产物，与预期符合(见图1C、D);经Western blotting鉴定其成功表达。BCA试剂盒测定蛋白浓度为1.6 mg/ml，蛋白总表达量为4.5 mg。在Bio-Rad凝胶成像仪经图像分析测得蛋白纯度为92.2%。
2.2 rRv1626刺激受试者产生特异性IFN-γ水平比较 委托山西长治医学院附属医院检验科筛选出符合临床诊断标准的受试者共40例，其中健康对照者、ATB患者和LTBI受试者及分别为10例、14例和16例。rRv1626蛋白诱导M.tb感染者外周血中淋巴细胞产生的IFN-γ水平均显著高于健康者对照者(P<0.001)，同时诱导ATB人群外周血中淋巴细胞分泌IFN-γ水平显著高于LTBI人群(P<0.001)，见图2A。非特异性刺激物PHA诱导受试者外周血中淋巴细胞产生的IFN-γ水平无统计学差异(P>0.01)，见图2B。
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2.3 Rv1626/DMT免疫小鼠诱导高水平的特异性IgG抗体 TMD组产生的IgG抗体及其亚类无显著的特异性;BCG+Rv1626/DMT组产生的特异性相关抗体滴度显著高于Rv1626/DMT组及BCG组(P<0.01);Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组的IgG2a/IgG1比值显著高于DMT组和BCG组(F=33.69)，且前两组IgG2a /IgG1>1，倾向于Th1型细胞免疫应答，见图3。
2.4 Rv1626/DMT免疫小鼠脾细胞分泌高水平特异性Th1型细胞因子 不同免疫组小鼠无论是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT组均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次为BCG组、Rv1626/DMT组，PBS组为最低。同时Rv1626/DMT组显著高于DMT组(P<0.01)。PPD刺激时，BCG组水平显著高于Rv1626/DMT组、rRv1626刺激时则反之(P<0.01);各组表达的IL-4水平均较低且无显著差异，见图4。
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3 讨论
筛选M.tb感染后多个不同时期优势表达抗原，并以之为候选靶抗原构建TB亚单位疫苗，已成为当今新型结核疫苗研究的重要策略之一。目前，绝大多数的新型结核亚单位疫苗仍聚焦于复制期优势表达抗原，如Ag85A、Ag85B和Rv3619等被广泛用于TB疫苗研究中，且均证实具有较好的免疫保护效果[3]。近年来，已有12条疫苗进入临床试验阶段，涉及表达单个或多个靶抗原的不同形式的疫苗有7种，其中亚单位疫苗有4种，尤其以单表达分泌期优势抗原为重要研究靶点。本课题的重要意义在于通过人群和动物实验筛选出具有潜力的分泌期靶抗原。
Rv1626是M.tb感染复制期分泌的重要抗原[4]。Derrick SC等[5]在2013年使用结核分枝杆菌攻击小鼠模型测试了16种抗原，实验结果显示，Rv1626可显著降低实验感染动物的肺、脾脏的荷菌量，能诱导强烈的Th1型细胞免疫，刺激分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細胞因子。通过上调INF-γ激活巨噬细胞，增强其吞噬能力和加工提呈抗原能力，最终有效地杀死M.tb，以及升高IL-2水平以保护宿主抵抗M.tb的感染。可见Rv1626可能是潜在的免疫原性较强的靶抗原，可刺激机体分泌较高水平的抗原特异性Th1型细胞因子。
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本研究首次构建并成功克隆表达原核质粒pPROEX-Rv1626，通过人群实验，证实Rv1626诱导ATB者产生的IFN-γ水平显著高于LTBI者，同时刺激ATB和LTBI受试者产生的特异性IFN-γ水平显著高于健康者，提示了Rv1626是可被M.tb 感染人群T细胞所识别的特异性抗原，是具有潜力的疫苗靶抗原。在免疫小鼠9周后以及以BCG初免、Rv1626增强免疫后，均诱导了较高水平的TNF-α、IL-2和IFN-γ，同时Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组小鼠血清IgG2a /IgG1>1，倾向于Th1型细胞免疫应答。
综上所述，本研究证实了Rv1626可被山西长治市M.tb感染人群T细胞特异性识别。在动物免疫原性实验中检测到实验组抗原特异性Th1型细胞因子水平低于BCG组，可能与Rv1626仅为单个靶抗原、刺激水平不够有关;这也在BCG+Rv1626/DMT组诱导的相关细胞因子水平均显著高于BCG组和Rv1626/DMT组得到了验证。rRv1626可被TB感染人群T细胞所识别、具有较好的免疫原性，为研制M.tb感染人群(尤其是LTBIs)的预防及治疗型疫苗提供了候选靶抗原。本课题研究筛选并构建了M.tb感染复制期优势表达抗原，并对其免疫原性进行了深入分析，为构建包含多阶段抗原的融合疫苗、有效提高其抗M.tb感染的保护性研究奠定了坚实的基础。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Schmit KM，Wansaula Z，Pratt R，et al.Tuberculosis - United States，2016[J].Mmwr Morbidity & Mortality Weekly Report，2017，66(11)：289-294.
[2]Singhal N，Bisht D，Joshi B.Immunoprophylaxis of tuberculosis： an update of emerging trends[J].Arch Immunol Ther Exp，2010，58(2)：97-106.
[3]Evans TG，Schrager L，Thole J.Status of vaccine research and development of vaccines for tuberculosis[J].Vaccine，2016，34(26)：2911-2914.
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[4]Reyes PR，Parlane NA，Wedlock DN，et al.Immunogencity of antigens from Mycobacterium tuberculosis， self-assembled as particulate vaccines[J].International Journal of Medical Microbiology，2016，306(8)：624-632.
[5]Derrick SC，Yabe IM，Yang A，et al.Immunogenicity and protective efficacy of novel Mycobacterium tuberculosis antigens[J].Vaccine，2013，31(41)：4641-4646., http://www.100md.com(袁伟 许礼发 王晓春 张京燕 朱心怡)
2.1 pPROEX-Rv1626原核表达载体的构建、表达纯化和免疫印迹分析 经PCR扩增出大小为612 bp的序列片段，插入pPROEX后，成功构建重组质粒pPROEX-Rv1626。经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切及测序鉴定无误(见图1A、B)。rRv1626蛋白诱导表达并经Ni-NTA柱以变性条件纯化后，获得分子量为22.4 kD蛋白产物，与预期符合(见图1C、D);经Western blotting鉴定其成功表达。BCA试剂盒测定蛋白浓度为1.6 mg/ml，蛋白总表达量为4.5 mg。在Bio-Rad凝胶成像仪经图像分析测得蛋白纯度为92.2%。
2.2 rRv1626刺激受试者产生特异性IFN-γ水平比较 委托山西长治医学院附属医院检验科筛选出符合临床诊断标准的受试者共40例，其中健康对照者、ATB患者和LTBI受试者及分别为10例、14例和16例。rRv1626蛋白诱导M.tb感染者外周血中淋巴细胞产生的IFN-γ水平均显著高于健康者对照者(P<0.001)，同时诱导ATB人群外周血中淋巴细胞分泌IFN-γ水平显著高于LTBI人群(P<0.001)，见图2A。非特异性刺激物PHA诱导受试者外周血中淋巴细胞产生的IFN-γ水平无统计学差异(P>0.01)，见图2B。
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2.3 Rv1626/DMT免疫小鼠诱导高水平的特异性IgG抗体 TMD组产生的IgG抗体及其亚类无显著的特异性;BCG+Rv1626/DMT组产生的特异性相关抗体滴度显著高于Rv1626/DMT组及BCG组(P<0.01);Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组的IgG2a/IgG1比值显著高于DMT组和BCG组(F=33.69)，且前两组IgG2a /IgG1>1，倾向于Th1型细胞免疫应答，见图3。
2.4 Rv1626/DMT免疫小鼠脾细胞分泌高水平特异性Th1型细胞因子 不同免疫组小鼠无论是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT组均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次为BCG组、Rv1626/DMT组，PBS组为最低。同时Rv1626/DMT组显著高于DMT组(P<0.01)。PPD刺激时，BCG组水平显著高于Rv1626/DMT组、rRv1626刺激时则反之(P<0.01);各组表达的IL-4水平均较低且无显著差异，见图4。
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3 讨论
筛选M.tb感染后多个不同时期优势表达抗原，并以之为候选靶抗原构建TB亚单位疫苗，已成为当今新型结核疫苗研究的重要策略之一。目前，绝大多数的新型结核亚单位疫苗仍聚焦于复制期优势表达抗原，如Ag85A、Ag85B和Rv3619等被广泛用于TB疫苗研究中，且均证实具有较好的免疫保护效果[3]。近年来，已有12条疫苗进入临床试验阶段，涉及表达单个或多个靶抗原的不同形式的疫苗有7种，其中亚单位疫苗有4种，尤其以单表达分泌期优势抗原为重要研究靶点。本课题的重要意义在于通过人群和动物实验筛选出具有潜力的分泌期靶抗原。
Rv1626是M.tb感染复制期分泌的重要抗原[4]。Derrick SC等[5]在2013年使用结核分枝杆菌攻击小鼠模型测试了16种抗原，实验结果显示，Rv1626可显著降低实验感染动物的肺、脾脏的荷菌量，能诱导强烈的Th1型细胞免疫，刺激分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細胞因子。通过上调INF-γ激活巨噬细胞，增强其吞噬能力和加工提呈抗原能力，最终有效地杀死M.tb，以及升高IL-2水平以保护宿主抵抗M.tb的感染。可见Rv1626可能是潜在的免疫原性较强的靶抗原，可刺激机体分泌较高水平的抗原特异性Th1型细胞因子。
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本研究首次构建并成功克隆表达原核质粒pPROEX-Rv1626，通过人群实验，证实Rv1626诱导ATB者产生的IFN-γ水平显著高于LTBI者，同时刺激ATB和LTBI受试者产生的特异性IFN-γ水平显著高于健康者，提示了Rv1626是可被M.tb 感染人群T细胞所识别的特异性抗原，是具有潜力的疫苗靶抗原。在免疫小鼠9周后以及以BCG初免、Rv1626增强免疫后，均诱导了较高水平的TNF-α、IL-2和IFN-γ，同时Rv1626/DMT组和BCG+Rv1626/DMT组小鼠血清IgG2a /IgG1>1，倾向于Th1型细胞免疫应答。
综上所述，本研究证实了Rv1626可被山西长治市M.tb感染人群T细胞特异性识别。在动物免疫原性实验中检测到实验组抗原特异性Th1型细胞因子水平低于BCG组，可能与Rv1626仅为单个靶抗原、刺激水平不够有关;这也在BCG+Rv1626/DMT组诱导的相关细胞因子水平均显著高于BCG组和Rv1626/DMT组得到了验证。rRv1626可被TB感染人群T细胞所识别、具有较好的免疫原性，为研制M.tb感染人群(尤其是LTBIs)的预防及治疗型疫苗提供了候选靶抗原。本课题研究筛选并构建了M.tb感染复制期优势表达抗原，并对其免疫原性进行了深入分析，为构建包含多阶段抗原的融合疫苗、有效提高其抗M.tb感染的保护性研究奠定了坚实的基础。
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参考文献：
[1]Schmit KM，Wansaula Z，Pratt R，et al.Tuberculosis - United States，2016[J].Mmwr Morbidity & Mortality Weekly Report，2017，66(11)：289-294.
[2]Singhal N，Bisht D，Joshi B.Immunoprophylaxis of tuberculosis： an update of emerging trends[J].Arch Immunol Ther Exp，2010，58(2)：97-106.
[3]Evans TG，Schrager L，Thole J.Status of vaccine research and development of vaccines for tuberculosis[J].Vaccine，2016，34(26)：2911-2914.
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[4]Reyes PR，Parlane NA，Wedlock DN，et al.Immunogencity of antigens from Mycobacterium tuberculosis， self-assembled as particulate vaccines[J].International Journal of Medical Microbiology，2016，306(8)：624-632.
[5]Derrick SC，Yabe IM，Yang A，et al.Immunogenicity and protective efficacy of novel Mycobacterium tuberculosis antigens[J].Vaccine，2013，31(41)：4641-4646., http://www.100md.com(袁伟 许礼发 王晓春 张京燕 朱心怡)