硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠的抗肿瘤作用研究(2)
Key words：Selenium polysaccharide;Anti-tumor;Breast cancer;SBP-1 protein
乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前，西医针对乳腺癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等，无论是肿瘤本身还是各种治疗手段均会给患者的生活和工作造成严重影响[2]。乳腺癌的发病率高，危害大，日益受到研究者的广泛关注。硒是机体生理活动必需的微量元素之一，在提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤方面均发挥着重要作用[3]。硒多糖作为一种有机硒化合物，既保持了多糖较高的生物利用率又具有硒的生物功能，对生物体的毒性大大降低，且活性明显高于硒和多糖[4]。硒多糖具有调节健康小鼠免疫功能的作用[5]，但硒多糖能够抑制乳腺癌细胞增殖的机制未见详细报道。硒结合蛋白1(selenium binding protein，SBP-1)是体内硒结合蛋白的一种，较正常组织相比，SBP-1在肿瘤组织中表达减少[6，7]。研究表明，SBP-1的表达增高有助于增强机体的抗癌能力，SBP-1可以成为乳腺癌的临床诊断和预后判断的指标[8]。本研究通过探讨硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠胸腺指数、脾指数、淋巴细胞转化率及SBP-1表达的影响，进一步探明硒多糖调节荷瘤机体免疫功能及抗肿瘤的机制，从而对硒多糖抗乳腺癌作用的相关性进行研究，为肿瘤的预防及免疫治疗提供新方向。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1实验动物 健康的雌性BALB/c小鼠40只，普通级，4～6周龄，体质量18～20 g，均由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供，本实验已经动物伦理委员会批准研究。
1.2主要试剂 MCF-7乳腺癌细胞株(由齐齐哈尔医学院医药研究所惠赠);RPMI1640完全培养基(购自美国Gibco);胎牛血清(购自杭州四季青生物公司);红细胞裂解液(购自Biosharp);MTT、二甲基亚砜(购自北京索莱宝生物公司);硒多糖(购自湖北天夏生物工程有限公司);环磷酰胺(购自通化茂祥制药有限公司);SBP1抗体(购自上海康朗生物科技有限公司);免疫组化试剂盒(购自福州迈新)。
1.3主要仪器 电子天平;倒置相差显微镜;超净工作台;离心机;CO2恒温培养箱;恒温水浴箱;高压锅;超低温冰箱(-80%);酶標仪;石蜡切片机;光学显微镜。
, 百拇医药
1.4方法
1.4.1动物分组 按体重进行蛇形分组，随机分为4组：正常组、模型组、硒多糖用药组、联合用药组，每组10只。
1.4.2造模 将MCF-7乳腺癌细胞传代培养，取生长良好的细胞，将细胞浓度调整至1×107个/ml，按0.1 ml/只于除正常组外其他3组小鼠的左侧膈腧穴处进行注射接种，从而建立小鼠乳腺癌模型[9，10]，正常组不建立乳腺癌模型。15 d后在可触及皮下肿瘤时证明已完成乳腺癌模型种植。
1.4.3给药 硒多糖用药组以400 mg/kg的硒多糖剂量予以给药[5];联合用药组以50 mg/kg的环磷酰胺，1次/2 d[11]以及400 mg/kg的硒多糖予以给药;模型组予以等剂量的生理盐水;正常组不予任何药物处理，给药方式均为灌胃给药，连续给药14 d。
1.4.4测胸腺指数、脾指数 用药结束后，用电子天平分别测量单只小鼠的体质量，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠的胸腺、脾脏，计算胸腺指数、脾指数。
, http://www.100md.com
1.4.5检测小鼠脾淋巴细胞转化率 取无菌脾脏研磨进行体外淋巴细胞培养，制成单个细胞悬液，将细胞浓度调整为3×106个/ml，并加入24孔培养板中(每孔1 ml)，将其分为实验组(每孔加50 μl PHA液)和对照组(不加PHA)，置5% CO2，37 ℃培养箱中培养68 h。取出，每孔吸去上清液0.7 ml，随后加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI1640培养液及5 mg/ml的MTT 50 μl/孔，继续置5% CO2，37 ℃培养箱中培养4 h。取出，加入二甲亚砜1 ml/孔，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶标仪在570 nm波长下测定光密度(OD)值。
1.4.6检测肿瘤组织中SBP-1的表达 取模型组、硒多糖用药组、联合用药组的肿瘤组织于10%甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、常规石蜡包埋、切片机切片、烤片、脱蜡、高压法修复抗原，应用Envision免疫组化试剂盒对切片进行染色，并滴加DAB显色剂显色，镜下控制显色时间并用自来水终止显色。随后用苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察各组肿瘤组织中SBP-1的表达情况，并应用Image-Pro Plus软件进行图片数据分析。
, 百拇医药
1.5统计学方法 实验数据用SPSS 20.0统计学软件进行分析，以(x±s)表示，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组小鼠胸腺指数、脾指数的比较 与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数均有所增高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数亦有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与硒多糖用药组相比联合用药组的胸腺指数、脾指数均有所提高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表1。
2.2各组小鼠淋巴细胞转化率比较 与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率均有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率亦有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与硒多糖用药组相比联合用药组的脾淋巴细胞转化率明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表2。, 百拇医药(薛玲 刘祥东 付思雨 李震 罗晓庆)
乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前，西医针对乳腺癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等，无论是肿瘤本身还是各种治疗手段均会给患者的生活和工作造成严重影响[2]。乳腺癌的发病率高，危害大，日益受到研究者的广泛关注。硒是机体生理活动必需的微量元素之一，在提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤方面均发挥着重要作用[3]。硒多糖作为一种有机硒化合物，既保持了多糖较高的生物利用率又具有硒的生物功能，对生物体的毒性大大降低，且活性明显高于硒和多糖[4]。硒多糖具有调节健康小鼠免疫功能的作用[5]，但硒多糖能够抑制乳腺癌细胞增殖的机制未见详细报道。硒结合蛋白1(selenium binding protein，SBP-1)是体内硒结合蛋白的一种，较正常组织相比，SBP-1在肿瘤组织中表达减少[6，7]。研究表明，SBP-1的表达增高有助于增强机体的抗癌能力，SBP-1可以成为乳腺癌的临床诊断和预后判断的指标[8]。本研究通过探讨硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠胸腺指数、脾指数、淋巴细胞转化率及SBP-1表达的影响，进一步探明硒多糖调节荷瘤机体免疫功能及抗肿瘤的机制，从而对硒多糖抗乳腺癌作用的相关性进行研究，为肿瘤的预防及免疫治疗提供新方向。
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1材料与方法
1.1实验动物 健康的雌性BALB/c小鼠40只，普通级，4～6周龄，体质量18～20 g，均由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供，本实验已经动物伦理委员会批准研究。
1.2主要试剂 MCF-7乳腺癌细胞株(由齐齐哈尔医学院医药研究所惠赠);RPMI1640完全培养基(购自美国Gibco);胎牛血清(购自杭州四季青生物公司);红细胞裂解液(购自Biosharp);MTT、二甲基亚砜(购自北京索莱宝生物公司);硒多糖(购自湖北天夏生物工程有限公司);环磷酰胺(购自通化茂祥制药有限公司);SBP1抗体(购自上海康朗生物科技有限公司);免疫组化试剂盒(购自福州迈新)。
1.3主要仪器 电子天平;倒置相差显微镜;超净工作台;离心机;CO2恒温培养箱;恒温水浴箱;高压锅;超低温冰箱(-80%);酶標仪;石蜡切片机;光学显微镜。
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1.4方法
1.4.1动物分组 按体重进行蛇形分组，随机分为4组：正常组、模型组、硒多糖用药组、联合用药组，每组10只。
1.4.2造模 将MCF-7乳腺癌细胞传代培养，取生长良好的细胞，将细胞浓度调整至1×107个/ml，按0.1 ml/只于除正常组外其他3组小鼠的左侧膈腧穴处进行注射接种，从而建立小鼠乳腺癌模型[9，10]，正常组不建立乳腺癌模型。15 d后在可触及皮下肿瘤时证明已完成乳腺癌模型种植。
1.4.3给药 硒多糖用药组以400 mg/kg的硒多糖剂量予以给药[5];联合用药组以50 mg/kg的环磷酰胺，1次/2 d[11]以及400 mg/kg的硒多糖予以给药;模型组予以等剂量的生理盐水;正常组不予任何药物处理，给药方式均为灌胃给药，连续给药14 d。
1.4.4测胸腺指数、脾指数 用药结束后，用电子天平分别测量单只小鼠的体质量，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠的胸腺、脾脏，计算胸腺指数、脾指数。
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1.4.5检测小鼠脾淋巴细胞转化率 取无菌脾脏研磨进行体外淋巴细胞培养，制成单个细胞悬液，将细胞浓度调整为3×106个/ml，并加入24孔培养板中(每孔1 ml)，将其分为实验组(每孔加50 μl PHA液)和对照组(不加PHA)，置5% CO2，37 ℃培养箱中培养68 h。取出，每孔吸去上清液0.7 ml，随后加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI1640培养液及5 mg/ml的MTT 50 μl/孔，继续置5% CO2，37 ℃培养箱中培养4 h。取出，加入二甲亚砜1 ml/孔，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶标仪在570 nm波长下测定光密度(OD)值。
1.4.6检测肿瘤组织中SBP-1的表达 取模型组、硒多糖用药组、联合用药组的肿瘤组织于10%甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、常规石蜡包埋、切片机切片、烤片、脱蜡、高压法修复抗原，应用Envision免疫组化试剂盒对切片进行染色，并滴加DAB显色剂显色，镜下控制显色时间并用自来水终止显色。随后用苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察各组肿瘤组织中SBP-1的表达情况，并应用Image-Pro Plus软件进行图片数据分析。
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1.5统计学方法 实验数据用SPSS 20.0统计学软件进行分析，以(x±s)表示，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组小鼠胸腺指数、脾指数的比较 与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数均有所增高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数亦有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与硒多糖用药组相比联合用药组的胸腺指数、脾指数均有所提高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表1。
2.2各组小鼠淋巴细胞转化率比较 与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率均有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率亦有所提高，差异有统计学意义(P<0.05);与硒多糖用药组相比联合用药组的脾淋巴细胞转化率明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表2。, 百拇医药(薛玲 刘祥东 付思雨 李震 罗晓庆)