原代小鼠小胶质细胞培养及尼古丁抑制肿瘤坏死因子α分泌的研究(2)
2.2小胶质细胞分离培养 Poly-L-Lysine(PLL)包被Lab-TekII Chamber Slide(8 wells)。混合細胞培养14 d后取出,用封口膜封闭培养瓶瓶盖,置于摇床上,在100 rps ,37℃条件下摇晃3 h。摇晃结束后吸取培养液,置于15 ml离心管中,4℃,2000 r/min,离心5 min。在原来的T-25 flask中仍加入小胶质细胞完全培养基,放入培养箱,继续培养(每瓶flask可进行4~5次小胶质细胞分离)。弃离心管中上层液体。用小胶质细胞培养液重悬,种于已包被腔室载玻片及12孔板(5×106 ml-1)中。2.3免疫荧光细胞化学染色 实验孔中加入10 μg/ml LPS处理4 h。取种于腔室载玻片中的小胶质细胞,PBS洗3次,每次5 min。放入4%多聚甲醛(PFA)对细胞进行固定,20 min后用 PBS洗涤,每次5 min,共3次。0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)透膜处理5 min ......
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