原代小鼠小胶质细胞培养及尼古丁抑制肿瘤坏死因子α分泌的研究(1)
摘要：目的 本研究通过摇床法分离纯化培养小鼠原代小胶质细胞，并研究尼古丁对小胶质细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α )的表达和分泌的影响。方法 從C57 BL/6新生鼠大脑中分离出皮层，切碎研磨后进行混合培养，摇床法分离纯化小胶质细胞并培养。CD11b、Iba1作为小胶质细胞特异性标记物用来检测、鉴定小胶质细胞，在激光共聚焦显微镜下观察、计数免疫荧光细胞化学染色后的阳性细胞。将纯化的小胶质细胞设置为三个组，分别为空白对照组，LPS组，LPS+NIC组。 LPS+NIC组先加入10 ug/ml LPS处理30 min，再加入10 μmol 尼古丁处理24 h。LPS组加入10 μg/ml LPS处理4 h。空白对照组不做任何处理。使用qPCR检测尼古丁对小胶质细胞TNF-α的表达，酶联免疫吸附实验检测尼古丁对小胶质细胞TNF-α分泌的影响。结果 培养混合细胞，再通过摇床法收获的小胶质细胞，细胞阳性率超过95.54%。免疫荧光细胞化学方法鉴定小胶质细胞纯度，小胶质细胞特异性标志物CD11b、Iba1，星形胶质细胞标志物GFAP检测结果，ImageJ分析小胶质细胞阳性率>95.54%，星型胶质细胞<4%，其它细胞<2%;LPS处理组与LPS+NIC处理组相比较，LPS+NIC组TNF-α的RNA水平的表达明显降低，且差异有统计学意义(P<0.05);LPS单独处理组，小胶质细胞TNF-α分泌增加。而LPS+NIC组小胶质细胞TNF-α分泌降低，两组TNF-α分泌有明显差异，且有统计学意义(P<0.05)。结论 利用差异贴壁，分离纯化得到了高纯度的小鼠原代小胶质细胞，相较于其它方法，对细胞的损伤小，可多次收获小胶质细胞，细胞得率高。尼古丁可抑制小鼠原代小胶质细胞TNF-α 的分泌，可能为神经退行性疾病的治疗提供新的治疗方法。
, 百拇医药
关键词：小胶质细胞;原代培养;尼古丁;肿瘤坏死因子
中图分类号：R322.81 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.031
文章编号：1006-1959(2019)02-0111-04
炎症反应(inflammatory reaction)是由先天免疫系统对抗内源性和外源性的损伤形成身体的自卫机制。小胶质细胞是中枢神经系统中胚胎来源的自我更新组织的巨噬细胞，在大脑、脊髓、视网膜和嗅球中均有存在[1]。小胶质细胞有多种功能，包括支持中枢神经系统发育和突触形成、维持体内平衡、对感染源的免疫反应，以及参与成人神经形成、神经炎症、退行性疾病、中风、创伤和再生[2]。当小胶质细胞被激活后，往往伴随神经炎症反应的发生。这种神经炎症反应可能通过清除神经毒性因子起到神经保护作用[3]，但它们也可能通过促炎介质和氧化应激水平升高导致神经变性，以及神经递质水平改变，而成为神经毒性，致使神经元死亡，记忆减少和海马功能障碍[3-5]。已有证据显示尼古丁在神经退行性疾病的治疗过程中可以产生有利的影响[6]。小胶质细胞在调节炎症反应的内源性神经免疫机制中，起着重要作用。本实验通过摇床法分离纯化小胶质细胞，并探索尼古丁对小胶质细胞参与的炎症反应的作用。
, 百拇医药
1材料
1.1实验动物与仪器 实验动物购于常州卡维昂公司(许可证号SCXY(Su)2011-0003)6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，雄性小鼠3只，雌性小鼠9只。离心机(平凡仪器，TDZ5-WS)，摇床(DragonLAB，SK-D1807-E)，细胞培养箱(ESCO，CCL-170B-8)，显微镜(Leica)，共聚焦显微镜(Olympus，FV1000)
1.2实验材料与试剂 60×15 mm细胞培养皿(corning)，六孔板(corning)，25 m2细胞培养瓶(T-25 flask，Thermo)， 腔室载玻片(Lab-TekII Chamber Slide，8 wells)，胎牛血清(FBS，Gibco)，胶质细胞基础培养基(DMEM /High glucose，HyClone)，青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin，Gibco)，L-15条件培养基(Leibovitz's L-15 conditioned media)，牛血清白蛋白(BSA)，0.9%氯化钠注射液，无水乙醇(上海试剂一厂)，anti-Iba1 antibody(Wako;# 019-19741)，anti-CD11b antibody(biolegend;#101201)，anti-GFAP antibody(abcam;#ab7260)， 山羊抗兔IgG(H&L)二抗 (Alexa Fluor 594;life technology)，山羊抗大鼠IgG(H&L)二抗 (Alexa Fluor 488;life technology)， 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，碧云天)，免疫荧光防淬灭剂(碧云天)
, http://www.100md.com
2方法
2.1混合胶质细胞的取材与培养 喂养6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，适应2周，雌雄3∶1配对，待雌鼠怀孕后分笼。取材器械高压灭菌，取雌鼠所生2～4 d新生鼠8只。放入75%酒精中浸泡消毒。取出小鼠，用剪刀剪断小鼠头部，并转入75%酒精中再次消毒2 min，之后转入0.9%氯化钠注射液浸泡2 min，在60×15 mm平皿中加入 L-15(L-15+0.1%BSA+1%pen/strep)条件培养基，将浸泡在0.9%氯化钠注射液中的小鼠脑转入其中。剥离新生鼠脑膜，取出大脑皮层在新的L-15条件培养基中轻柔切碎组织，并转入15 ml离心管，4℃，2000 r/min，离心5 min，弃去上清。所有实验步骤均需在冰上操作。用5～6 ml小胶质细胞完全培养基(DMEM+10%FBS+1%pen/strep)重悬细胞，准备5个T-25 flask，各加入已预热(37℃)的小胶质细胞完全培养基3 ml，将15 ml离心管中细胞上下吹打10次，并转移至已准备好的5个T-25 flask中，每瓶1 ml。5%CO2，37℃培养箱，培养5 d，全量换液，以后每隔3 d半量换液[7]。, http://www.100md.com(刘菲 胡玉婷 刘静 毛若颖 陶欣荣)
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关键词：小胶质细胞;原代培养;尼古丁;肿瘤坏死因子
中图分类号：R322.81 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.031
文章编号：1006-1959(2019)02-0111-04
炎症反应(inflammatory reaction)是由先天免疫系统对抗内源性和外源性的损伤形成身体的自卫机制。小胶质细胞是中枢神经系统中胚胎来源的自我更新组织的巨噬细胞，在大脑、脊髓、视网膜和嗅球中均有存在[1]。小胶质细胞有多种功能，包括支持中枢神经系统发育和突触形成、维持体内平衡、对感染源的免疫反应，以及参与成人神经形成、神经炎症、退行性疾病、中风、创伤和再生[2]。当小胶质细胞被激活后，往往伴随神经炎症反应的发生。这种神经炎症反应可能通过清除神经毒性因子起到神经保护作用[3]，但它们也可能通过促炎介质和氧化应激水平升高导致神经变性，以及神经递质水平改变，而成为神经毒性，致使神经元死亡，记忆减少和海马功能障碍[3-5]。已有证据显示尼古丁在神经退行性疾病的治疗过程中可以产生有利的影响[6]。小胶质细胞在调节炎症反应的内源性神经免疫机制中，起着重要作用。本实验通过摇床法分离纯化小胶质细胞，并探索尼古丁对小胶质细胞参与的炎症反应的作用。
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1.1实验动物与仪器 实验动物购于常州卡维昂公司(许可证号SCXY(Su)2011-0003)6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，雄性小鼠3只，雌性小鼠9只。离心机(平凡仪器，TDZ5-WS)，摇床(DragonLAB，SK-D1807-E)，细胞培养箱(ESCO，CCL-170B-8)，显微镜(Leica)，共聚焦显微镜(Olympus，FV1000)
1.2实验材料与试剂 60×15 mm细胞培养皿(corning)，六孔板(corning)，25 m2细胞培养瓶(T-25 flask，Thermo)， 腔室载玻片(Lab-TekII Chamber Slide，8 wells)，胎牛血清(FBS，Gibco)，胶质细胞基础培养基(DMEM /High glucose，HyClone)，青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin，Gibco)，L-15条件培养基(Leibovitz's L-15 conditioned media)，牛血清白蛋白(BSA)，0.9%氯化钠注射液，无水乙醇(上海试剂一厂)，anti-Iba1 antibody(Wako;# 019-19741)，anti-CD11b antibody(biolegend;#101201)，anti-GFAP antibody(abcam;#ab7260)， 山羊抗兔IgG(H&L)二抗 (Alexa Fluor 594;life technology)，山羊抗大鼠IgG(H&L)二抗 (Alexa Fluor 488;life technology)， 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，碧云天)，免疫荧光防淬灭剂(碧云天)
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2方法
2.1混合胶质细胞的取材与培养 喂养6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，适应2周，雌雄3∶1配对，待雌鼠怀孕后分笼。取材器械高压灭菌，取雌鼠所生2～4 d新生鼠8只。放入75%酒精中浸泡消毒。取出小鼠，用剪刀剪断小鼠头部，并转入75%酒精中再次消毒2 min，之后转入0.9%氯化钠注射液浸泡2 min，在60×15 mm平皿中加入 L-15(L-15+0.1%BSA+1%pen/strep)条件培养基，将浸泡在0.9%氯化钠注射液中的小鼠脑转入其中。剥离新生鼠脑膜，取出大脑皮层在新的L-15条件培养基中轻柔切碎组织，并转入15 ml离心管，4℃，2000 r/min，离心5 min，弃去上清。所有实验步骤均需在冰上操作。用5～6 ml小胶质细胞完全培养基(DMEM+10%FBS+1%pen/strep)重悬细胞，准备5个T-25 flask，各加入已预热(37℃)的小胶质细胞完全培养基3 ml，将15 ml离心管中细胞上下吹打10次，并转移至已准备好的5个T-25 flask中，每瓶1 ml。5%CO2，37℃培养箱，培养5 d，全量换液，以后每隔3 d半量换液[7]。, http://www.100md.com(刘菲 胡玉婷 刘静 毛若颖 陶欣荣)