血清miR-145表达与乳腺癌患者的相关性分析(2)
1资料与方法
1.1一般资料 选取2014年8月~2017年8月于上海市建工医院收治的160例乳腺癌患者,均为女性,按照是否存在骨转移分为乳腺癌骨转移组及乳腺癌非骨转移组,各80例。其中乳腺癌骨转移组,年龄31~74岁,平均年龄(52.57±6.36)岁,病程9个月~9年6个月,平均病程(5.20±2.61)年;乳腺癌非骨转移组,年龄32~77岁,平均年龄(57.70±5.25)岁,病程7个月~9年3个月,平均病程(4.28±3.66)年。纳入的所有患者原发灶均经过穿刺活检或病理切片检查明确为乳腺癌,骨转移病灶经计算机断层扫描、核磁共振成像或放射性核素扫描确认至少有1处转移灶。本研究经医院伦理委员会审批通过,患者均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1标本采集 所有血清标本均于患者明确诊断后未行手术治疗、放化疗、内分泌治疗之前采集。使用不含抗凝剂的真空采血管采集 两组患者外周静脉血5 ml,于4℃下2500 r/min 离心15 min,取上层血清液移至不含RNA酶的冻存管中,置入-80℃冰箱保存。
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1.2.2 RNA提取与miR-145实时定量PCR(qPCR)检测 血清样本中总RNA的提取采用Trizol试剂按操作说明书提取,采用Nano-Drop 2000检测提取RNA的浓度并调节浓度为200 ng/μL,取2 μL按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA。每个样本取2 μg,qPCR采用SYBR法检测,反应体系按上海生博生物公司mRNA荧光定量试剂盒操作规定进行操作,qPCR扩增反应条件:94℃ 10 min预变性, 94℃ 30 s变性,60℃ 1 min退火,共45个循环。将cDNA于ABI Prism7300型实时定量PCR仪进行qPCR检测。miR-145上游引物:5'-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3',下游引物:5'-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3'。以U6为miR-145的内参基因,所有反应均设立3个复孔,采用2-Ct计算相对表达量。
1.3观察指标及评价标准 比较两组miR-145相对表达量,分析其与有无骨转移,骨转移程度、骨痛程度的相关关系。采用疼痛视觉模拟评分(VAS评分)评价骨痛程度,按疼痛严重程度分组,0~3分为轻度组、4~6分为中度组、7~10分为重度组。采用Soloway分级标准评价肿瘤转移程度及CT、MRI、PET-CT的检查结果所显示的骨转移病灶数量不同,1~6个转移灶为1级、7~20个转移灶为2级、>20个转移灶为3级。所有患者均经过12~36个月随访观察。
, 百拇医药
1.4统计学分析 采用SPSS19.0对数据进行统计分析。计量资料以(x±s)表示,采用独立样本t检验;组间比较采用单因素方差分析,相关性分析采用Spearman分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1 miR-145在乳腺癌骨转移与非骨转移患者血清样本中的差異表达 qPCR结果显示,miR-145在两组患者血清样本中均有表达,乳腺癌骨转移组患者血清miR-145相对表达量为(1.22±0.24)低于乳腺癌非骨转移组的(2.57±0.38),差异有统计学意义(t=10.96,P=0.02)。
2.2 miR-145相对表达量与骨转移患者骨痛程度及骨转移程度的相关性分析 经Spearman相关性分析发现,miR-145与骨转移患者的骨痛程度及骨转移程度呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
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3讨论
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤,在我国每年有近17万女性罹患乳腺癌。乳腺癌骨转移是乳腺癌最常见的转移灶。乳腺癌骨转移会导致病理性骨折、剧烈骨痛、神经功能障碍严重影响生活质量,而其早期症状往往不明显,一旦出现上述症状则多为疾病中晚期,临床治疗效果不佳。寻找一种简单有效、且特异性高的实验室检查方法对乳腺癌骨转移患者的早期筛查有重要的临床意义。Matamala N等[9]研究表明mRNA不仅仅在组织细胞中,而且在血清中也能稳定存在。血清标本比较容易获得且近年来qPCR技术的日臻成熟,这就为利用mRNA表达筛查诊断乳腺癌骨转移提供了比较可靠的技术路线。
Chang Y等[10]研究表明miR-145可通过调控MAP3K1来抑制非小细胞性肺癌的转化进程。Sheng N等[11]研究显示miR-145表达可以抑制结肠癌细胞的侵袭与迁移,其在结肠癌细胞中的表达下调。以上研究表明miR-145在恶性肿瘤的进程中可以发挥抑制的作用,这也与本实验的研究结果一致。本研究结果显示乳腺癌骨转移患者血清中miR-145相对表达量低于非骨转移患者,差异有统计学意义(P<0.05);且miR-145相对表达量与乳腺癌骨转移患者的骨转移程度、骨痛程度呈负相关,miR-145相对表达量越低,患者的骨痛明显,患者骨转移程度越高,差异有统计学意义(P<0.05)。提示miR-145可能参与了乳腺癌骨转移相关的生物学进程,包含miR-145在内的miRNA家族参与多种生物学进程,包括细胞的增殖、定向分化、凋亡等,其调控及表达异常均可导致细胞的病理进程。生物信息学研究发现SOX11可能是miR-145作用的靶基因。SOX家族是在细胞生长中起关键调节作用的一组转录因子,SOX11在抑癌及促癌中的作用已被广泛研究[12,13]。但miR-145通过靶向调节SOX11及其下游关于肿瘤骨转移的具体调节机制仍有待进一步的实验研究。
综上所述,miR-145在在乳腺癌骨转移患者血清中的相对表达量相较于非骨转移患者显著下调,且其下调程度与骨痛程度及转移程度均呈相关性,miR-145可作为乳腺癌骨转移的潜在诊断与筛查方法。, 百拇医药(卜易莹 韩东兴 刘邦令)
1.1一般资料 选取2014年8月~2017年8月于上海市建工医院收治的160例乳腺癌患者,均为女性,按照是否存在骨转移分为乳腺癌骨转移组及乳腺癌非骨转移组,各80例。其中乳腺癌骨转移组,年龄31~74岁,平均年龄(52.57±6.36)岁,病程9个月~9年6个月,平均病程(5.20±2.61)年;乳腺癌非骨转移组,年龄32~77岁,平均年龄(57.70±5.25)岁,病程7个月~9年3个月,平均病程(4.28±3.66)年。纳入的所有患者原发灶均经过穿刺活检或病理切片检查明确为乳腺癌,骨转移病灶经计算机断层扫描、核磁共振成像或放射性核素扫描确认至少有1处转移灶。本研究经医院伦理委员会审批通过,患者均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1标本采集 所有血清标本均于患者明确诊断后未行手术治疗、放化疗、内分泌治疗之前采集。使用不含抗凝剂的真空采血管采集 两组患者外周静脉血5 ml,于4℃下2500 r/min 离心15 min,取上层血清液移至不含RNA酶的冻存管中,置入-80℃冰箱保存。
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1.2.2 RNA提取与miR-145实时定量PCR(qPCR)检测 血清样本中总RNA的提取采用Trizol试剂按操作说明书提取,采用Nano-Drop 2000检测提取RNA的浓度并调节浓度为200 ng/μL,取2 μL按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA。每个样本取2 μg,qPCR采用SYBR法检测,反应体系按上海生博生物公司mRNA荧光定量试剂盒操作规定进行操作,qPCR扩增反应条件:94℃ 10 min预变性, 94℃ 30 s变性,60℃ 1 min退火,共45个循环。将cDNA于ABI Prism7300型实时定量PCR仪进行qPCR检测。miR-145上游引物:5'-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3',下游引物:5'-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3'。以U6为miR-145的内参基因,所有反应均设立3个复孔,采用2-Ct计算相对表达量。
1.3观察指标及评价标准 比较两组miR-145相对表达量,分析其与有无骨转移,骨转移程度、骨痛程度的相关关系。采用疼痛视觉模拟评分(VAS评分)评价骨痛程度,按疼痛严重程度分组,0~3分为轻度组、4~6分为中度组、7~10分为重度组。采用Soloway分级标准评价肿瘤转移程度及CT、MRI、PET-CT的检查结果所显示的骨转移病灶数量不同,1~6个转移灶为1级、7~20个转移灶为2级、>20个转移灶为3级。所有患者均经过12~36个月随访观察。
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1.4统计学分析 采用SPSS19.0对数据进行统计分析。计量资料以(x±s)表示,采用独立样本t检验;组间比较采用单因素方差分析,相关性分析采用Spearman分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1 miR-145在乳腺癌骨转移与非骨转移患者血清样本中的差異表达 qPCR结果显示,miR-145在两组患者血清样本中均有表达,乳腺癌骨转移组患者血清miR-145相对表达量为(1.22±0.24)低于乳腺癌非骨转移组的(2.57±0.38),差异有统计学意义(t=10.96,P=0.02)。
2.2 miR-145相对表达量与骨转移患者骨痛程度及骨转移程度的相关性分析 经Spearman相关性分析发现,miR-145与骨转移患者的骨痛程度及骨转移程度呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
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3讨论
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤,在我国每年有近17万女性罹患乳腺癌。乳腺癌骨转移是乳腺癌最常见的转移灶。乳腺癌骨转移会导致病理性骨折、剧烈骨痛、神经功能障碍严重影响生活质量,而其早期症状往往不明显,一旦出现上述症状则多为疾病中晚期,临床治疗效果不佳。寻找一种简单有效、且特异性高的实验室检查方法对乳腺癌骨转移患者的早期筛查有重要的临床意义。Matamala N等[9]研究表明mRNA不仅仅在组织细胞中,而且在血清中也能稳定存在。血清标本比较容易获得且近年来qPCR技术的日臻成熟,这就为利用mRNA表达筛查诊断乳腺癌骨转移提供了比较可靠的技术路线。
Chang Y等[10]研究表明miR-145可通过调控MAP3K1来抑制非小细胞性肺癌的转化进程。Sheng N等[11]研究显示miR-145表达可以抑制结肠癌细胞的侵袭与迁移,其在结肠癌细胞中的表达下调。以上研究表明miR-145在恶性肿瘤的进程中可以发挥抑制的作用,这也与本实验的研究结果一致。本研究结果显示乳腺癌骨转移患者血清中miR-145相对表达量低于非骨转移患者,差异有统计学意义(P<0.05);且miR-145相对表达量与乳腺癌骨转移患者的骨转移程度、骨痛程度呈负相关,miR-145相对表达量越低,患者的骨痛明显,患者骨转移程度越高,差异有统计学意义(P<0.05)。提示miR-145可能参与了乳腺癌骨转移相关的生物学进程,包含miR-145在内的miRNA家族参与多种生物学进程,包括细胞的增殖、定向分化、凋亡等,其调控及表达异常均可导致细胞的病理进程。生物信息学研究发现SOX11可能是miR-145作用的靶基因。SOX家族是在细胞生长中起关键调节作用的一组转录因子,SOX11在抑癌及促癌中的作用已被广泛研究[12,13]。但miR-145通过靶向调节SOX11及其下游关于肿瘤骨转移的具体调节机制仍有待进一步的实验研究。
综上所述,miR-145在在乳腺癌骨转移患者血清中的相对表达量相较于非骨转移患者显著下调,且其下调程度与骨痛程度及转移程度均呈相关性,miR-145可作为乳腺癌骨转移的潜在诊断与筛查方法。, 百拇医药(卜易莹 韩东兴 刘邦令)