乌司他丁预处理对HepG2细胞氧化损伤保护作用的研究(2)
Key words：Ulinastatin;Autophagy;Apoptosis;Oxidative stress
肝脏担负着人体的重要生理功能，肝脏损伤引起肝功能代谢障碍，继而引起的一系列临床症状，对患者造成一定的痛苦和经济负担。药物性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等肝病的共同病理基础是肝细胞损伤[1]。乌司他丁(ulinastatin，UTI)是从健康男性尿液提取的一种蛋白酶抑制剂，具有强大的广谱溶酶体酶抑制功能，具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用[2]。临床上常用于急性胰腺炎、急性循环衰竭的救治。氧化应激是肝细胞损伤中一个重要的损伤机制，是各种肝脏疾病发生发展的共同病理基础[3]。本研究通过模拟离体急性肝细胞损伤，探讨UTI预处理对肝细胞自噬调控、凋亡的影响，为肝损伤的救治提供实验和理论依据。
1材料与方法
1.1材料 人肝癌细胞HepG2由中国科学院肿瘤医院提供;胎牛血清购自Gibco公司;DMEM及0.25%胰酶购自美国Invitrogen公司;兔抗小鼠LC3B、β-actin、Cleaved caspase-3抗体购自于美国CST公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒美国Roche;山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗购自于武汉三鹰;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8，CCK-8)购自于日本同仁公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。
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1.2方法
1.2.1 HepG2细胞培养 将HepG2 细胞常规复苏，加入离心管中，吹打混匀，离心机中离心(800 r/min，5 min)，弃上清，使用高糖型DMEM培养基并加10%胎牛血清配制而成的培养液，移入培养瓶中，于37℃ 5%CO2培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞，待细胞长至约85%密度时，可以传代，经消化分散后，接种于塑料培养皿中，置于培养箱内进行培养。
1.2.2实验分组 将传代好的HepG2细胞分随机为5组，对照组不作任何处理，其余4组分别加入浓度为0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI预处理24 h后，加入300 μmol/L H2O2处理4 h，体外模拟肝细胞损伤。
1.2.3 CCK-8细胞活力检测 将HePG2细胞悬液浓度调整为5×107/L，每孔200 μL接种于96孔板上，按上述分组，每组接种8孔，经UTI预处理H2O2损伤后。加入20 μL 的CCK-8溶液在孵箱中继续孵育2 h，在全自动酶标仪450 nm下检测吸光度(optical density， OD)。
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1.2.4 LDH释放量测定 各组经处理后，取其培养液。根据说明书配置标准品后，取其标准品和待测样品各5 μl加入96孔板，每孔再加入底物工作液100 μl，37℃孵育5 min读取吸光值A1。孵育30 min后用酶标仪在490 nm处测吸光值A2。再用A2值减去A1值等于最终OD值。以OD值为纵坐标，各标准品为横坐标，作标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相对应的LDH含量。
1.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 4%多聚甲醛固定细胞，避光条件下，按9∶1混匀TUNEL试剂盒中的A液和B液，加入配置好的TUNEL反应液，加入待检测细胞爬片中，放入37℃恒温孵育1 h。PBS清洗后封片，Hoechst 染料染核5 min，在荧光显微镜下观察并拍照，计算凋亡率。凋亡率=TUNEL阳性细胞数/Hoechst细胞总数×100%。
1.2.6 Western blot检测LC3和Cleaved caspase-3表达变化 收集各组细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后转移到硝酸纤维素膜上，和LC3(1∶3000)、Cleaved caspase-3(1∶500)与β-actin(1∶3000)抗体结合，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，电化发光法显色后照相。最后用Image master VDS成像系统摄影，图像分析件(Image J)行灰度扫描分析。以目的蛋白与β-actin的蛋白产物条带灰度值之比作为其蛋白水平的相对量。并进行扫描图像分析仪计算蛋白条带的表达。
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1.3统计学方法 应用GraphPad prism 5软件处理数据。连续变量以(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析，同组间两两比较用t检验进行统计学分析，以P<0.05表示差異有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著，P<0.001表示统计学意义极显著。
2结果
2.1各组CKK-8细胞活性检测结果比较 与对照组比较，H2O2组细胞活性显著下降为(46.30±1.40)%;而UTI100+H2O2组，UTI500+H2O2组，UTI1000+H2O2组细胞活性随浓度逐渐增强，分别为(53.58±1.80)%，(58.90±1.45)%，(66.08±0.89)%，见图1。
2.2 LDH释放量检测 结果显示，各UTI处理组与H2O2组比较，LDH检测率减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.3 TUNEL检测细胞凋亡 在荧光显微镜下观察细胞凋亡如图2所示。通过TUNEL阳性细胞计数，对照组阳性细胞(4.00±0.31)%，H2O2组神经元凋亡率达(62.80±0.86)%，UTI1000+H2O2组阳性细胞(34.00±0.70)%，对照组与H2O2组比较，统计学意义显著(P<0.01)，见图3。, http://www.100md.com(杨巧侠 王成果 王元欣)
肝脏担负着人体的重要生理功能，肝脏损伤引起肝功能代谢障碍，继而引起的一系列临床症状，对患者造成一定的痛苦和经济负担。药物性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等肝病的共同病理基础是肝细胞损伤[1]。乌司他丁(ulinastatin，UTI)是从健康男性尿液提取的一种蛋白酶抑制剂，具有强大的广谱溶酶体酶抑制功能，具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用[2]。临床上常用于急性胰腺炎、急性循环衰竭的救治。氧化应激是肝细胞损伤中一个重要的损伤机制，是各种肝脏疾病发生发展的共同病理基础[3]。本研究通过模拟离体急性肝细胞损伤，探讨UTI预处理对肝细胞自噬调控、凋亡的影响，为肝损伤的救治提供实验和理论依据。
1材料与方法
1.1材料 人肝癌细胞HepG2由中国科学院肿瘤医院提供;胎牛血清购自Gibco公司;DMEM及0.25%胰酶购自美国Invitrogen公司;兔抗小鼠LC3B、β-actin、Cleaved caspase-3抗体购自于美国CST公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒美国Roche;山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗购自于武汉三鹰;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8，CCK-8)购自于日本同仁公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。
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1.2方法
1.2.1 HepG2细胞培养 将HepG2 细胞常规复苏，加入离心管中，吹打混匀，离心机中离心(800 r/min，5 min)，弃上清，使用高糖型DMEM培养基并加10%胎牛血清配制而成的培养液，移入培养瓶中，于37℃ 5%CO2培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞，待细胞长至约85%密度时，可以传代，经消化分散后，接种于塑料培养皿中，置于培养箱内进行培养。
1.2.2实验分组 将传代好的HepG2细胞分随机为5组，对照组不作任何处理，其余4组分别加入浓度为0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI预处理24 h后，加入300 μmol/L H2O2处理4 h，体外模拟肝细胞损伤。
1.2.3 CCK-8细胞活力检测 将HePG2细胞悬液浓度调整为5×107/L，每孔200 μL接种于96孔板上，按上述分组，每组接种8孔，经UTI预处理H2O2损伤后。加入20 μL 的CCK-8溶液在孵箱中继续孵育2 h，在全自动酶标仪450 nm下检测吸光度(optical density， OD)。
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1.2.4 LDH释放量测定 各组经处理后，取其培养液。根据说明书配置标准品后，取其标准品和待测样品各5 μl加入96孔板，每孔再加入底物工作液100 μl，37℃孵育5 min读取吸光值A1。孵育30 min后用酶标仪在490 nm处测吸光值A2。再用A2值减去A1值等于最终OD值。以OD值为纵坐标，各标准品为横坐标，作标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相对应的LDH含量。
1.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 4%多聚甲醛固定细胞，避光条件下，按9∶1混匀TUNEL试剂盒中的A液和B液，加入配置好的TUNEL反应液，加入待检测细胞爬片中，放入37℃恒温孵育1 h。PBS清洗后封片，Hoechst 染料染核5 min，在荧光显微镜下观察并拍照，计算凋亡率。凋亡率=TUNEL阳性细胞数/Hoechst细胞总数×100%。
1.2.6 Western blot检测LC3和Cleaved caspase-3表达变化 收集各组细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后转移到硝酸纤维素膜上，和LC3(1∶3000)、Cleaved caspase-3(1∶500)与β-actin(1∶3000)抗体结合，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，电化发光法显色后照相。最后用Image master VDS成像系统摄影，图像分析件(Image J)行灰度扫描分析。以目的蛋白与β-actin的蛋白产物条带灰度值之比作为其蛋白水平的相对量。并进行扫描图像分析仪计算蛋白条带的表达。
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1.3统计学方法 应用GraphPad prism 5软件处理数据。连续变量以(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析，同组间两两比较用t检验进行统计学分析，以P<0.05表示差異有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著，P<0.001表示统计学意义极显著。
2结果
2.1各组CKK-8细胞活性检测结果比较 与对照组比较，H2O2组细胞活性显著下降为(46.30±1.40)%;而UTI100+H2O2组，UTI500+H2O2组，UTI1000+H2O2组细胞活性随浓度逐渐增强，分别为(53.58±1.80)%，(58.90±1.45)%，(66.08±0.89)%，见图1。
2.2 LDH释放量检测 结果显示，各UTI处理组与H2O2组比较，LDH检测率减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.3 TUNEL检测细胞凋亡 在荧光显微镜下观察细胞凋亡如图2所示。通过TUNEL阳性细胞计数，对照组阳性细胞(4.00±0.31)%，H2O2组神经元凋亡率达(62.80±0.86)%，UTI1000+H2O2组阳性细胞(34.00±0.70)%，对照组与H2O2组比较，统计学意义显著(P<0.01)，见图3。, http://www.100md.com(杨巧侠 王成果 王元欣)