李茗薇，黄 茹，严青秀，李可悦，王丽滢，王 飞

    (1.安徽理工大学第一附属医院/淮南市第一人民医院妇产科，安徽 淮南 232007；2.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232063)

    我国每年新发恶性肿瘤数超400 万，但随着抗肿瘤治疗的不断发展，恶性肿瘤患者的生存率也在不断提高，越来越多女性在肿瘤治愈后有了更加迫切的生育需求，特别是对于年轻女性患者来说，70%以上有期待生育的愿望[1，2]，因此恶性肿瘤患者的生育力保护愈加受到重视。生育力保护的技术主要包括卵母细胞冻存、胚胎冻存和卵巢组织冻存移植。目前，卵母细胞冻存与胚胎冻存技术已趋于成熟，但对适用人群有诸多限制，而卵巢组织冻存移植技术为保护生育力开辟了一条新途径，也是急需治疗的恶性肿瘤患者保存生育力的最佳选项[3，4]。冷冻保存技术不仅可以节约超促排卵的高昂费用，同时还可以储备大量原始卵泡。由于卵巢组织内包含着多种类型的细胞，并有着独特和复杂的结构，原始卵泡和初级卵泡被大量单层颗粒细胞所围绕，因此其冻融是一项困难的任务。卵巢组织常用的冷冻方法有玻璃化冷冻法和程序化冷冻法两类[4，5]。本研究采用程序化冷冻法，通过对小鼠卵巢组织进行体外冷冻保存和原位移植技术，建立小鼠生育力保护和内分泌重构的模型，进一步验证卵巢冷冻保存技术和原位移植技术的安全性和有效性，为保护女性生育能力提供临床基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 选取8 周龄SPF 级C57BL/6J 成熟雌鼠30 只，体重16.6～18.8 g，均由安徽理工大学实验动物中心提供。小鼠饲养温度为(21±2)℃，相对湿度30%～70%，光照明暗交替周期为12 h/d。本实验方案由安徽理工大学第一附属医院伦理委员会批准，并通过动物实验伦理审查。将小鼠随机分为3 组：研究A 组10 只、研究B 组10 只和对照组10 只。

    1.2 实验试剂与设备 试剂：3%水合氯醛、M2 培养基、HAS(人血清白蛋白)、DMSO、PBS、4%的多聚甲醛、瑞氏染液。冷冻基础液为含20%HAS 的M2 培养基。冷冻保护液为用冷冻基础液配制的1.5M 的DMSO(即1 mlDMSO，基础液定容至10 ml)。设备：显微剪、平台镊、手术直剪、带线缝合针、持针器、1 ml 注射器、1.8 ml 冷冻管、35 mm 一次性培养皿、程序降温盒、解剖镜 ......