附子总生物碱中乌头碱\新乌头碱\次乌头碱在大鼠体内的药动学研究*(1)
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摘要：目的：研究口服附子总生物碱后乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在大鼠体内的药动学特征。方法：口服给予大鼠附子总生物碱后，断尾取血，采用甲醇沉淀冷冻干燥法处理血浆样品。采用HPLC-MS/MS分析方法检测乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的血药浓度。药时数据用中国药理学会3p97药代动力学程序计算主要药动学参数。结果：本实验建立的用于检测大鼠血浆的HPLC-MS/MS分析方法，其灵敏度高、专属性强、稳定性好，能很好的符合生物样品分析的要求。乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的药动学曲线经拟合均符合口服给药的二室模型。乌头碱主要药动参数：T1/2α=3.32±1.56min，T1/2β=886.61±242.14min，AUC=86.558±9.462mg•L-1•min-1，Tpeak=6.989±1.546min，Cmax=83.549±10.459ng•mL-1。新乌头碱主要药动参数：T1/2α=15.4989±4.8712min，T1/2β=1255.808±684.891min，AUC=297.212±74.642ng•mL-1•min，Tpeak=15.782±7.541min，Cmax=202.983±30.781ng•mL-1。次乌头碱主要药动参数：T1/2α=125.482±51.654min，T1/2β=1007.757±349.485min，AUC=241.206±9.147ng•mL-1•min，Tpeak=16.765±5.478min，Cmax=164.302±20.891ng•mL-1。结论：灌胃给予附子总生物碱后乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在大鼠体内的过程符合口服二室模型。
关键词：附子；附子总生物碱；乌头碱；新乌头碱；次乌头碱；HPLC-MS/MS；毒代动力学
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2011)03-0049-04
乌头类有毒中药如川乌、草乌、附子等是中医临床常用的有毒中药。已有研究表明乌头类有毒中药具有强心[1~5]、抗休克[6]、抗心律失常[7]、抗炎镇痛[8~9]、致心律失常[10]抑制呼吸中枢、兴奋迷走中枢等作用，乌头碱类生物碱如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱既是乌头、附子中的主要有毒成分，也是发挥部分药效的主要有效成分。近年来乌头碱类生物碱的毒理学研究越来越深入，如已有文献报道了乌头碱对结肠间质细胞、神经细胞、心肌细胞、大鼠胚胎等的影响机制[11~13]，但体内过程的研究相对较少。
由于乌头碱类生物碱毒性大，动物血浆内的含量较低，对热不稳定，容易发生水解。有研究发现乌头碱在甲醇溶液中不稳定，常温下放置短时间即可产生新的物质[14~15]。故本实验运用高灵敏的HPLC-MS/MS检测样品中乌头碱类生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)的含量，采用甲醇沉淀冻干法处理血浆样品，对口服给予附子总生物碱后乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在大鼠体内的药动学特点进行研究。
1实验材料
1.1实验仪器API3000质谱仪(AB公司)；Dionex高效液相色谱仪；WH-1微型旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；TCL-16g型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；FD-1B-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；
1.2试剂与试药乌头碱(Aconitine，A)，中国药品生物制品检定所提供，批号：110720-200410；新乌头碱(Mesaconitine，MA)，中国药品生物制品检定所提供，批号：110798-200404；次乌头碱(Hypaconitine，HA)，中国药品生物制品检定所提供，批号：110799-200505；附子双酯型生物碱，为本课题组化学组提供，经HPLC测定生物碱含量为：乌头碱：0.0778mg/mL，新乌头碱：0.978mg/mL，次乌头碱：0.3274mg/mL。甲醇为色谱纯，三乙胺、二氯甲烷、盐酸等为分析纯，水为双蒸水。
1.3实验动物SD大鼠，雌雄各半，成都中医药大学动物实验中心提供(实验动物生产许可证号：08-049)，体重(280±20)g，健康合格，检疫后备用。
2实验方法
2.1检测条件
2.1.1高效液相色谱条件色谱柱：PhenomenexGeminiC18，Φ250mm×Φ4.6mm，5μm；预柱：Phenomenex；ChromGuardHPLCC18Column，Φ4mm×3mm，5μm，流动相：甲醇-水-三乙胺=80∶20∶0.1流速：0.6mL•min-1；柱温：40℃；进样量：20μL。
2.1.2质谱条件离子源：ESI，正离子MRM扫描，CUR13.0L•min-1，CAD6.0L•min-1，IS：5500V，TEM：450℃，GS1：33.0L•min-1，GA2：33.0L•min-1，DP：100.0V，FP400.0V，EP：11.0V，CE：60.0V.
MRM检测：乌头碱：646.0/586.0，646.0/105.0；次乌头碱：616.3/338.5；新乌头碱：632.0/105.0
2.2对照品溶液的配制分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品适量，用二氯甲烷制成每1mL含0.135mg，0.104mg和0.132mg的溶液。再取一定量溶液以二氯甲烷稀释成浓度分别为1.35、1.04和1.32μg/mL的对照品溶液保存在4℃的避光冰箱中备用。
2.3样品处理方法取血浆样品200μL置于离心管中，按1∶4的比例加入甲醇800μL，涡旋振荡3min，沉淀蛋白，按10000r•min-1离心10min，取上清液，加入双蒸水配成甲醇浓度为20%的溶液，置于冻干瓶中冷冻干燥，于检测前向冻干瓶中加入400μL甲醇，旋涡震荡3min，按10000r•min-1离心5min，取上清液进样测定。
2.4毒代动力学实验取SD大鼠，6只，雌雄各半，体重(280±20)g。灌胃附子总生物碱，折算成乌头碱、新乌头碱、次乌头碱剂量为：乌头碱0 ......
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