HPLC法测定民族药露水草中β-蜕皮激素的含量(1)
摘要：目的 露水草中β-蜕皮激素的含量测定。方法 采用高效液相法对露水草中β-蜕皮激素含量进行测定。色谱柱为Agilent Extend-C18柱(4.6×150 mm，粒径5 μm);流动相为甲醇-水(40：60);柱温35℃;检测波长248 nm;流速1.00 mL/min;进样量5 μL。结果 β-蜕皮甾酮溶液在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL濃度范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9999)。平均回收率为102.02%(n=6)，RSD值为1.0%。结论 本方法重复性好，稳定性好，精密度高，适用于β-蜕皮甾酮的含量测定。
关键词：β-蜕皮甾酮;高效液相色谱法(DAD UV检测器);含量测定
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2019)03-0070-05
20-羟基蜕皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)又称β-蜕皮激素(β-ecdysone)，是一种昆虫的变态激素，可用于防治害虫及提高虾蟹产量[1]。化学式为C27H44O7[2]。其不仅能促进昆虫变态，还具有很多药理活性[3]。具有促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂、产生新的生命细胞和生殖细胞的作用[4]。还可促进动物的生长发育，促进细胞增殖分化，促进蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢，保护神经系统、心血管系统、肝脏等功效[5]。其主要作用是促进核酸和蛋白质的合成，影响糖代谢和脂类代谢，免疫调节机体。高剂量的蜕皮激素能扰乱昆虫体内的正常代谢过程，所以用于防治害虫[6]。在运动保健方面，β-蜕皮激素具有显著的通过增加氨基酸装配成蛋白链，从而刺激肌肉细胞质中蛋白质合成的能力，而且该能力回溯至蛋白质生长的转译和转移的过程[7]。蜕皮甾酮类甾体化合物广泛的存在于不同科属的植物中[8]。迄今为止，露水草是昆明植物所聂瑞麟先生发现的自然界中含植物甾酮类成分最丰富的药用植物之一[9]。本次实验选用露水草为提取原料。露水草(Cyanotis C.B.Clark)又名珍珠露水草、换肺散、鸡冠参等，为鸭跖草科(Commelinacede)蓝耳草属多年生宿根性草本，分布于中国、印度、斯里兰卡及中南半岛，我国主要分布于云南、贵州、广西、广东、福建、台湾等省(区)海拔1100～1700 m的山沟、山坡林缘或林中[10]。
综合实验室条件等各种原因，此次试验采用高效液相色谱法(HPLC)测定β-蜕皮激素的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 梅特勒托利多万分之一电子天平(型号 MS204);电热鼓风干燥箱(型号 101-0EBS);超声清洗仪器(型号 CPXS800H-C);安捷伦高效液相色谱仪(型号 1260 DAD UV检测器)。
1.2 试药 露水草全草干草;β-蜕皮甾酮对照品(批号：111638-201304，含量以按95.8%计，中国食品药品检定研究院);乙腈、甲醇(色谱纯);其他化学试剂为分析纯;水为超纯水。
2 方法条件的选择与结果
2.1 检测波长的确定 精密称取β-蜕皮甾酮对照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含β-蜕皮甾酮0.5001 mg的对照品贮备液。精密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度为30 μg/mL)。取样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷至室温，定容至刻度，作为供试品溶液。取上述供试品溶液及对照品溶液，在乙腈-水(15：85)、乙腈-甲醇-水(14：28：58)、甲醇-水(40：60)三种流动相中分别进样，DAD UV HPLC色谱仪在波长200～600 nm扫描，得出最大吸收波长。结果显示对照品溶液及供试品溶液均在λ=248 nm处有最大吸收，且无杂峰干扰，因此后续实验检测波长确定为248 nm。
2.2 色谱柱的选择 选用4.6 mm×250 mm，粒径5 μm色谱柱测量时，保留时间接近半小时，用时过长，且保留时间波动较大，峰面积不稳定，所以选择4.6 mm×150 mm，粒径5 μm色谱柱，短柱保留时间在5 min左右，相比之下，缩短了试验时间，且峰面积与长柱相比较稳定。选择出4.6 mm×150mm色谱柱。
2.3 样品提取方法的选择 本实验采用超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种方式进行提取，结果显示采用索式提取β-蜕皮甾酮含量相对较高;但预实验时索式提取四份样品精密度较差，提取近14 h才至无色比较费时且存在温度难控等因素，相较于超声及振荡提取，β-蜕皮甾酮含量相近，但考虑到操作性，最终采用超声提取。
2.4 提取溶剂的确定 本实验采用甲醇、乙醇两种溶剂通过超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种提取方式提取，三种提取方式结果都显示甲醇溶剂提取时含量相对较高，最终确定采用甲醇溶剂提取。
2.5 流动相的确定 预实验时标准品以及三种方法提取所得的样品都分别在检测波长248 nm，三种流动相乙腈-水(15：85)[11]、乙腈-甲醇-水(14：28：58)、甲醇-水(40：60)[11]条件下进样。通过对比保留时间、色谱吸收峰峰型以及峰面积，乙腈-水(15：85)为流动相时出峰时间相对另外两种较长;乙腈-甲醇-水(14：28：58)为流动相时分离度达不到要求;甲醇-水(40：60)为流动相时保留时间相对较短，峰形较好，峰面积较稳定，所以确定以甲醇-水(40：60)为流动相。, 百拇医药(杨勇帮 李媛媛 李继琪)
关键词：β-蜕皮甾酮;高效液相色谱法(DAD UV检测器);含量测定
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2019)03-0070-05
20-羟基蜕皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)又称β-蜕皮激素(β-ecdysone)，是一种昆虫的变态激素，可用于防治害虫及提高虾蟹产量[1]。化学式为C27H44O7[2]。其不仅能促进昆虫变态，还具有很多药理活性[3]。具有促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂、产生新的生命细胞和生殖细胞的作用[4]。还可促进动物的生长发育，促进细胞增殖分化，促进蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢，保护神经系统、心血管系统、肝脏等功效[5]。其主要作用是促进核酸和蛋白质的合成，影响糖代谢和脂类代谢，免疫调节机体。高剂量的蜕皮激素能扰乱昆虫体内的正常代谢过程，所以用于防治害虫[6]。在运动保健方面，β-蜕皮激素具有显著的通过增加氨基酸装配成蛋白链，从而刺激肌肉细胞质中蛋白质合成的能力，而且该能力回溯至蛋白质生长的转译和转移的过程[7]。蜕皮甾酮类甾体化合物广泛的存在于不同科属的植物中[8]。迄今为止，露水草是昆明植物所聂瑞麟先生发现的自然界中含植物甾酮类成分最丰富的药用植物之一[9]。本次实验选用露水草为提取原料。露水草(Cyanotis C.B.Clark)又名珍珠露水草、换肺散、鸡冠参等，为鸭跖草科(Commelinacede)蓝耳草属多年生宿根性草本，分布于中国、印度、斯里兰卡及中南半岛，我国主要分布于云南、贵州、广西、广东、福建、台湾等省(区)海拔1100～1700 m的山沟、山坡林缘或林中[10]。
综合实验室条件等各种原因，此次试验采用高效液相色谱法(HPLC)测定β-蜕皮激素的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 梅特勒托利多万分之一电子天平(型号 MS204);电热鼓风干燥箱(型号 101-0EBS);超声清洗仪器(型号 CPXS800H-C);安捷伦高效液相色谱仪(型号 1260 DAD UV检测器)。
1.2 试药 露水草全草干草;β-蜕皮甾酮对照品(批号：111638-201304，含量以按95.8%计，中国食品药品检定研究院);乙腈、甲醇(色谱纯);其他化学试剂为分析纯;水为超纯水。
2 方法条件的选择与结果
2.1 检测波长的确定 精密称取β-蜕皮甾酮对照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含β-蜕皮甾酮0.5001 mg的对照品贮备液。精密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度为30 μg/mL)。取样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷至室温，定容至刻度，作为供试品溶液。取上述供试品溶液及对照品溶液，在乙腈-水(15：85)、乙腈-甲醇-水(14：28：58)、甲醇-水(40：60)三种流动相中分别进样，DAD UV HPLC色谱仪在波长200～600 nm扫描，得出最大吸收波长。结果显示对照品溶液及供试品溶液均在λ=248 nm处有最大吸收，且无杂峰干扰，因此后续实验检测波长确定为248 nm。
2.2 色谱柱的选择 选用4.6 mm×250 mm，粒径5 μm色谱柱测量时，保留时间接近半小时，用时过长，且保留时间波动较大，峰面积不稳定，所以选择4.6 mm×150 mm，粒径5 μm色谱柱，短柱保留时间在5 min左右，相比之下，缩短了试验时间，且峰面积与长柱相比较稳定。选择出4.6 mm×150mm色谱柱。
2.3 样品提取方法的选择 本实验采用超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种方式进行提取，结果显示采用索式提取β-蜕皮甾酮含量相对较高;但预实验时索式提取四份样品精密度较差，提取近14 h才至无色比较费时且存在温度难控等因素，相较于超声及振荡提取，β-蜕皮甾酮含量相近，但考虑到操作性，最终采用超声提取。
2.4 提取溶剂的确定 本实验采用甲醇、乙醇两种溶剂通过超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种提取方式提取，三种提取方式结果都显示甲醇溶剂提取时含量相对较高，最终确定采用甲醇溶剂提取。
2.5 流动相的确定 预实验时标准品以及三种方法提取所得的样品都分别在检测波长248 nm，三种流动相乙腈-水(15：85)[11]、乙腈-甲醇-水(14：28：58)、甲醇-水(40：60)[11]条件下进样。通过对比保留时间、色谱吸收峰峰型以及峰面积，乙腈-水(15：85)为流动相时出峰时间相对另外两种较长;乙腈-甲醇-水(14：28：58)为流动相时分离度达不到要求;甲醇-水(40：60)为流动相时保留时间相对较短，峰形较好，峰面积较稳定，所以确定以甲醇-水(40：60)为流动相。, 百拇医药(杨勇帮 李媛媛 李继琪)