甘草多糖诱导的树突状细胞生物学特性研究(1)
摘要：目的 从人外周血获取单核细胞，并利用GPS将其诱导分化为DCs，研究GPS对DCs分化成熟、表型的影响。方法 密度梯度离心法及细胞贴壁法获取人外周血单核细胞;对不同分组(细胞因子组、甘草多糖组、联合组)的单核细胞进行体外诱导培养;倒置相差显微镜、瑞氏-姬姆萨染色法观察各组DCs形态变化;Western Blot对比各组DCs标志物蛋白表达差异。结果 各组单核细胞体外培养均可诱导为DCs，符合DCs形态学特征，以联合组数量最多、体积最大、突起最显，细胞染色强于它组;Western Blot显示各组细胞标志物蛋白(CD80、CD40、CD83、CD86)均符合DCs表型特征，并随细胞成熟而表达增强，表达量以联合组最明显。结论 GPS可诱导DCs的分化成熟，且协同细胞因子效果更佳。这为进一步从DCs角度探讨GPS增强人体免疫和抗肿瘤机制提供了研究基础。
关键词：树突状细胞;甘草多糖;单核细胞;分化成熟;表型
中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2020)02-0072-07
树突状细胞(dendritic cells，DCs)作为目前功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，它能摄取各类抗1-3原，在机体细胞免疫和体液免疫调控中均起着重要作用。因此，从DCs角度来制备相应的抗肿瘤疫苗是当前肿瘤研究的热点[1]。DCs在人体内含量甚微，仅占外周血单核细胞的1%左右，因此体外培养和扩增DCs对制备抗肿瘤DCs疫苗具有重要意义。寻找合适的DCs前体细胞来源，体外诱导分化以獲得足量DCs来制备疫苗是DCs抗肿瘤治疗的前提和关键。国内外众多人员从中医药调节免疫和抗肿瘤的角度开展了很多研究，发现许多中药多糖可诱导DCs在体外的分化成熟，同时，在一定程度上呈剂量依赖性。甘草多糖(Glyeyrrhiza polysaeeharide，GPS)为中药甘草的重要有效成分，主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，具有多方面的生物活性。药理研究发现[2]，GPS具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、防止骨关节炎等作用，而且具有无细胞毒性的特点。GPS能够提高人体免疫和抑制肿瘤生长，但其具体作用机制有待于进一步探讨。DCs的发现和研究的深入，为GPS免疫抗肿瘤的机制提供了新的视角，即GPS抗肿瘤的机制是否与DCs的增殖、成熟和表型以及功能的改变有关，其诱导成熟的DCs是否具有刺激T细胞增殖的能力，以及与经典细胞因子诱导的DCs在功能上有何区别等？明确GPS与DCs之间的相互作用，从而为GPS应用于临床抗肿瘤和制备相关抗肿瘤疫苗提供理论依据和基础研究支持。
1 实验材料
1.1 实验用人外周血 新鲜人外周浓缩白细胞血：由贵州省血液中心提供。
1.2 实验药物 甘草多糖：纯度>90%，购自南京景竹生物科技有限公司，批号15020609。
1.3 实验试剂 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)、重组人干扰素α(rhTNF-α)：美国PeproTech公司;淋巴细胞分离液(Ficoll，D=1.077 g/mL)：达可为生物技术有限公司;快速瑞氏-姬姆萨染液试剂盒：南京建成生物技术有限公司;细胞膜蛋白抽提试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒、一步法快速WB试剂盒、抗β-Actin单克隆抗体、蛋白膜印迹再生液：北京康为生物技术有限公司;鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人CD80、鼠抗人CD40：北京中杉金桥生物技术公司。
1.4 仪器和设备 CJ-1D型超净台：天津泰斯特公司;TS-100F型倒置相差显微镜：日本尼康公司;CUSA31311型CO2培养箱：美国Napco公司;MSL-3020型三洋全自动45171008型低温高速离心机：湖南长沙湘仪公司;TC20型细胞计数仪、Mini Trans-Blot型蛋白转印系统、164-5050型电泳仪、Mini-PROTEAN型蛋白电泳槽：美国Bio-Rad公司;LIDE20型扫描仪：日本佳能公司。
2 实验方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 单核细胞的分离及imDCs、mDCs的获取 取新鲜人外周浓缩白细胞血40 mL，加入1倍体积RPMI1640培养液，1：1稀释铺于淋巴细胞液面上(淋巴细胞分离液与稀释浓缩白细胞血比例为1：2)，以室温，1800 rpm，18 min进行离心。吸取白膜层获得单个核细胞，并加入等体积RPMI1640培养液后，以室温、1000 rpm，10 min进行离心。弃去上清，根据混浊度重复1-2次。以适量RPMI1640 培养液重悬细胞沉淀，加入到75 cm3培养瓶中，培养箱内孵育1～3 h贴壁，即为单核细胞。
将细胞浓度调至5×105/mL，平均分为3组。A细胞因子组：加入rhGM-CSF液(终浓度为1000 U/mL)、rhIL-4液(终浓度为500 U/mL);B甘草多糖组：加入甘草多糖液(终浓度为400μg)。C联合组：加入rhGM-CSF液(终浓度为1000 U/mL)、rhIL-4液(终浓度为500 U/mL)及甘草多糖液(终浓度为400 μg)。入培养箱内常规培养5天，第3天培养基半换液，即可诱导为imDCs。各组imDCs 加入rhTNF-α(终浓度为50 U/mL)培养箱内常规培养3天，即可将 imDCs诱导成熟。
2.1.2 瑞氏-姬姆萨染色 取无菌24孔培养板，以多聚赖氨酸溶液进行包被，烘干清洗后照射紫外杀菌。将各组DCs细胞悬液接种于培养板中，入培养箱内培养1h使细胞贴壁，之后加入4%多聚甲醛固定液用以固定。最后使用快速瑞氏-姬姆萨染液试剂盒进行细胞染色。, 百拇医药(王树琪 李华 唐中生)
关键词：树突状细胞;甘草多糖;单核细胞;分化成熟;表型
中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2020)02-0072-07
树突状细胞(dendritic cells，DCs)作为目前功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，它能摄取各类抗1-3原，在机体细胞免疫和体液免疫调控中均起着重要作用。因此，从DCs角度来制备相应的抗肿瘤疫苗是当前肿瘤研究的热点[1]。DCs在人体内含量甚微，仅占外周血单核细胞的1%左右，因此体外培养和扩增DCs对制备抗肿瘤DCs疫苗具有重要意义。寻找合适的DCs前体细胞来源，体外诱导分化以獲得足量DCs来制备疫苗是DCs抗肿瘤治疗的前提和关键。国内外众多人员从中医药调节免疫和抗肿瘤的角度开展了很多研究，发现许多中药多糖可诱导DCs在体外的分化成熟，同时，在一定程度上呈剂量依赖性。甘草多糖(Glyeyrrhiza polysaeeharide，GPS)为中药甘草的重要有效成分，主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，具有多方面的生物活性。药理研究发现[2]，GPS具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、防止骨关节炎等作用，而且具有无细胞毒性的特点。GPS能够提高人体免疫和抑制肿瘤生长，但其具体作用机制有待于进一步探讨。DCs的发现和研究的深入，为GPS免疫抗肿瘤的机制提供了新的视角，即GPS抗肿瘤的机制是否与DCs的增殖、成熟和表型以及功能的改变有关，其诱导成熟的DCs是否具有刺激T细胞增殖的能力，以及与经典细胞因子诱导的DCs在功能上有何区别等？明确GPS与DCs之间的相互作用，从而为GPS应用于临床抗肿瘤和制备相关抗肿瘤疫苗提供理论依据和基础研究支持。
1 实验材料
1.1 实验用人外周血 新鲜人外周浓缩白细胞血：由贵州省血液中心提供。
1.2 实验药物 甘草多糖：纯度>90%，购自南京景竹生物科技有限公司，批号15020609。
1.3 实验试剂 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)、重组人干扰素α(rhTNF-α)：美国PeproTech公司;淋巴细胞分离液(Ficoll，D=1.077 g/mL)：达可为生物技术有限公司;快速瑞氏-姬姆萨染液试剂盒：南京建成生物技术有限公司;细胞膜蛋白抽提试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒、一步法快速WB试剂盒、抗β-Actin单克隆抗体、蛋白膜印迹再生液：北京康为生物技术有限公司;鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人CD80、鼠抗人CD40：北京中杉金桥生物技术公司。
1.4 仪器和设备 CJ-1D型超净台：天津泰斯特公司;TS-100F型倒置相差显微镜：日本尼康公司;CUSA31311型CO2培养箱：美国Napco公司;MSL-3020型三洋全自动45171008型低温高速离心机：湖南长沙湘仪公司;TC20型细胞计数仪、Mini Trans-Blot型蛋白转印系统、164-5050型电泳仪、Mini-PROTEAN型蛋白电泳槽：美国Bio-Rad公司;LIDE20型扫描仪：日本佳能公司。
2 实验方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 单核细胞的分离及imDCs、mDCs的获取 取新鲜人外周浓缩白细胞血40 mL，加入1倍体积RPMI1640培养液，1：1稀释铺于淋巴细胞液面上(淋巴细胞分离液与稀释浓缩白细胞血比例为1：2)，以室温，1800 rpm，18 min进行离心。吸取白膜层获得单个核细胞，并加入等体积RPMI1640培养液后，以室温、1000 rpm，10 min进行离心。弃去上清，根据混浊度重复1-2次。以适量RPMI1640 培养液重悬细胞沉淀，加入到75 cm3培养瓶中，培养箱内孵育1～3 h贴壁，即为单核细胞。
将细胞浓度调至5×105/mL，平均分为3组。A细胞因子组：加入rhGM-CSF液(终浓度为1000 U/mL)、rhIL-4液(终浓度为500 U/mL);B甘草多糖组：加入甘草多糖液(终浓度为400μg)。C联合组：加入rhGM-CSF液(终浓度为1000 U/mL)、rhIL-4液(终浓度为500 U/mL)及甘草多糖液(终浓度为400 μg)。入培养箱内常规培养5天，第3天培养基半换液，即可诱导为imDCs。各组imDCs 加入rhTNF-α(终浓度为50 U/mL)培养箱内常规培养3天，即可将 imDCs诱导成熟。
2.1.2 瑞氏-姬姆萨染色 取无菌24孔培养板，以多聚赖氨酸溶液进行包被，烘干清洗后照射紫外杀菌。将各组DCs细胞悬液接种于培养板中，入培养箱内培养1h使细胞贴壁，之后加入4%多聚甲醛固定液用以固定。最后使用快速瑞氏-姬姆萨染液试剂盒进行细胞染色。, 百拇医药(王树琪 李华 唐中生)
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