甲醛致大鼠鼻腔癌与K-ras癌基因活化相关
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摘 要：为探讨甲醛致大鼠鼻腔癌的分子机制，对甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中的转化序列进行检测。采用的实验方法，包括肿瘤细胞DNA与选择标志基因(neo)共转染、裸鼠成瘤性分析、Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)和序列分析等。结果发现：在第二轮裸鼠肿瘤DNA中含有大鼠源性的K-ras基因序列，而无大鼠源性的H-ras、N-ras和p53基因序列。这表明甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中所含的转化序列与H-ras、N-ras及p53基因无关，K-ras癌基因的活化可能参与甲醛致大鼠鼻腔癌。
关键词：甲醛；大鼠：鼻腔癌；K-ras：癌基因
中图分类号：R730
文献标识码：A
文章编号：1007—7847(2006)01—0071—06
甲醛是一种工业用途十分广泛的化学物质，在人们日常生活环境中也大量存在。对甲醛的致癌性进行流行病学、毒理学、病理学研究，发现甲醛可引起染色体异常、基因缺失、基因突变、细胞转化，长期慢性吸人甲醛可诱发动物肿瘤等，但甲醛致癌的具体机制迄今仍不清楚，因此甲醛被列为潜在致癌物。为了探讨甲醛致癌的分子机制。本文采用DNA共转染与裸鼠成瘤性分析相结合的方法，对来自甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中的转化序列进行了检测和初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 细胞系、质粒及裸鼠
甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7由陈主初教授在美国化学工业毒理学研究所(Clit)建立并带回，小鼠成纤维细胞系NIH3T3(CRL—1659)购自美国典型培养物中心(ATCC)，人膀胱癌细胞系T24及质粒pkjl·neo由本所保存。裸小鼠(BALB/Cnu/nu)购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2 主要试剂
胎牛血清，培养基DMEM、RPMll640均系美国Hyclone公司产品；分子生物学试剂，如随机引物标记试剂盒、PCR试剂盒、限制性核酸内切酶、低熔点琼脂糖等购自美国promega公司；DNA回收试剂盒为上海生工公司产品；转染试剂Fu-GENTM6和G418购自美国Roche公司；同位素a-32P-dCTP(3000ci/mm01)购自北京亚辉公司。其它常用试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3，1 DNA的提取和Southern杂交
质粒/真核细胞DNA的提取、酶切、电泳以及Southem杂交均参照文献的方法，探针回收和标记则按试剂盒说明书进行。
1.3，2 DNA共转染、G418筛选与棵鼠成瘤性分析
转染前24h，接种约5x105NIH3T3细胞于100mm平皿中培养过夜.转染时，先取3个含有770 1xL无血清DMEM的聚丙烯酰胺试管，分别于每管中加入30μL脂质体转染试剂，并轻轻混匀；同时于另外3个含有800 μL无血清DMEM的聚丙烯酰胺试管中分别加入FAT7、NIH3T3、T24细胞基因组DNA各30 ixg和pkj1-neo质粒DNA各300ng，同样轻轻混匀。再将加入了脂质体转染试剂的试管分别与加入不同细胞DNA试管中的液体混合，室温下静置15min。然后，用无血清DMEM给待转染的细胞换液，并将上述混合液加入到含有4mL无血清DMEM的细胞培养皿中，轻轻混匀后置37℃ C02培养箱孵育 ......
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