一种简便快速的聚合酶活性实时检测新方法(2)

http://www.100md.com 2006年6月1日 栾瑞波　孟祥贤　羊小海　王柯敏　谭蔚泓　郭秋平

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     胶电泳来进一步验证聚合反应，结果见图3。条带1是模板N1和引物N2的混合液，条带2是溶液A反应样品，条带3～5分别为溶液B、C、D反应样品。从条带2和条带1比较可以清楚看出，引物带N2消失，并且在模板上方出现了一条新的聚合产物带(为了区分聚合反应生成的产物和原有的模板，设计的引物的5，端相对模板N1多出2个碱基“AG"，因此条带2的模板上方的新带，即为引物在聚合酶的催化下发生延伸反应而形成的聚合产物)。在条带3～5中，发现当反应物里分别缺少KF-、Mg₂₊离子或dNTP Mixture时，均没有新的聚合产物带的出现，说明没有聚合反应发生。通过电泳，再次说明了图2曲线1中荧光强度的增加的确是由于发生了聚合反应形成的。

    2.3 聚合酶的定量分析

    利用上述监测方法，实时考察了一系列不同浓度的聚合酶催化的延伸反应。图4(a)是在溶液A中分别有5、4、2.5、1.5、1、0.5、0.25U的聚合酶KF-的时间扫描图。反应体积为200μL，则聚合酶的终浓度分别为25、20、12.5、7.5、5、2.5、1.25U/mL。随着聚合酶浓度的增加 ......

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