SEMA3B基因在鼻咽癌组织中的表达、杂合性丢失和甲基化分析(2)
 |
| 第6页 |
 |
| 第1页 |
 |
 |
 |
参见附件(632KB，6页)。
NaOH(0.3 mol/L)，混匀，37℃水浴变性15min；将新鲜配制的10mmol/L对苯二酚和3mol/L亚硫酸氢钠的混合液333μL加入变性的DNA中，55℃避光孵育4h；修饰的基因组DNA按照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒(TaKaRa)操作步骤进行脱盐纯化处理；在脱盐纯化的DNA中加入5.5μL 3 mol/L的NaOH，室温静置5～10min，使其脱磺化基团，然后在2.5倍体积无水乙醇中-20℃过夜，沉淀，最后重新溶解于20μL无DNA酶的灭菌水中，-20℃保存备用。
MSP扩增原理：用亚硫酸盐修饰基因组DNA后，DNA中的胞嘧啶由于甲基化状态的不同保留为“C”(胞嘧啶被甲基化时)或改变为“T”(胞嘧啶未甲基化时)；分别设计甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR扩增目的基因启动子区序列，就能检测出目的基因启动子区CpG岛甲基化情况。本研究中SEMA3B基因MSP扩增引物来自文献报道。PCR反应体系(20μL)中依次加入10×PCR缓冲液、0.25 mmol/LdNTPs、0.2μmol/L上游和下游引物、2μL亚硫酸氢钠修饰的DNA和0.5 unit热启动Taq聚合酶(TaKaRa)，反应的条件为：95℃变性10min；95℃30s，54℃30 s，72℃30 s，循环36次；72℃延伸10min。取10μLPCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上电泳分离，VDS凝胶成像系统照像。根据凝胶图像上相应条带的有无来判定各样品DNA中SE-MA3B基因启动子区甲基化状态，可分为完全甲基化、部分甲基化或非甲基化状态等3种情况。
1.2.5 统计学分析
采用SPSS11.0软件进行Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sumtest) ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(632KB，6页)。