金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达
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2013年3月1日
FvGDH,Gateway克隆,SDS-PAGE,Western,blotting
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李磊 杨远柱 刘泓 杜长青 林建中 朱咏华 刘选明 湖南大学生物学院;湖南亚华种业科学研究院;福建农林大学资源与环境学院;
【摘要】利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.
【关键词】 FvGDH Gateway克隆 原核表达 SDS-PAGE Western blotting
【基金】国家转基因生物新品种培育重大专项项目(2009ZX08001-030B) 国家自然科学基金面上项目(31170172) 湖南省自然科学基金资助项目(12JJ3024) 植物分子遗传国家重点实验室开放课题 中央高校基本科研业务费湖南大学重大前期培育项目 青年教师科技创新扶持项目资助
【分类号】S646.15;Q943.2
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)[1,2]是生物界中广泛存在的一种多聚酶,主要催化α-酮戊二酸还原氨基化和谷氨酸的氧化脱氨[α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+H+圳谷氨酸+H2O+NAD(P)+].在生物体中,以NADP+为辅酶的GDH作用于谷氨酸的合成,而以NADPH为辅酶的GDH则作用于谷
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