pIRES2—NGF—NT—3真核表达载体的构建与鉴定(2)
1.4pIRES2/NGF-NT-3双基因表达载体构建我们应用一种简单而有效的方法将未经双酶切的PCR扩增产物定向克隆入目的质粒中。我们针对一个基因设计了两对特异性的引物，该两对引物均含有限制性内切酶的部分序列，这两对引物分别用来做孪生PCR。即首先产生的PCR产物混合，经热变性和退火，以产生杂交的DNA片段，由此产生与特定内切酶相对应的粘性末端。这个方法在某些情况下是特别有用的，例如在克隆构建时必须要用到一种限制酶，但不巧的是这种限制酶切位点正好位于要扩增的序列内部，或者当PCR产物末端的限制性内切酶的敏感性不高而引起的某些问题，都可以采用这种方法。
我们采用长正向引物/长反向引物或者短正向引物/短反向引物两种引物对，以人的外周血单个核细胞基因组DNA为模板进行孪生PCR反应(图1)。两种反应体系的反应条件如下：94℃，30s；54℃，30s：72℃，1min，共30个循环，随后由72℃，5min进行延伸。PCR反应采用的聚合酶为Prime STAR Max DNA Polymerase ......
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