睾酮通过抑制Rab13表达影响支持细胞屏障通透性(2)
1.3.5 免疫印迹
NP-40裂解液(50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、2 mmol/L EGTA、lO% glycerol、l%， NonidetP-40、pH 8.0)处理睾丸或体外培养Sertoli细胞，提取总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。不同处理组蛋白(30 μg)经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显影，Scion Image软件扫描。β-actin做为蛋白内参照。
1.3.6 siRNA转染
由上海GenePhama公司合成大鼠Rab13 siR-NAs，预实验确定干扰效果。所用序列如下：Rab13 siRNA，5’-CAUCJUAAGUGCUCUUGAAGtt-3’，5'-CUUCAACAGCACUUACACCtt-3'；对照组sjRNA，5 ’-AGGAGAUGJUGAUAUUGGCUtt-3 ’，5 ’-AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt-3’。BLAST排除与其他基因序列的同源性。于培养第4d进行siRNA转染：在Opti-MEM中混匀siRNA及Re-boJuice转染试剂，根据预实验及培养密度确定siRNA浓度(TER测定实验150 nmol/L， Western及细胞染色100 nmol/L)：转染24 h后更换正常无血清培养液，继续培养48 h后收集细胞。
1.3.7 统计学分析
本研究中所涉及TER及Western印迹等实验结果采用GB-STAT分析软件(版本7.0； Dy-namlc microsystems)进行双因素方差分析及Dun-nett's检验，P<0.05为差异显著，P, http://www.100md.com(宿文辉 孟晓娜 贾晓宇)
NP-40裂解液(50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、2 mmol/L EGTA、lO% glycerol、l%， NonidetP-40、pH 8.0)处理睾丸或体外培养Sertoli细胞，提取总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。不同处理组蛋白(30 μg)经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显影，Scion Image软件扫描。β-actin做为蛋白内参照。
1.3.6 siRNA转染
由上海GenePhama公司合成大鼠Rab13 siR-NAs，预实验确定干扰效果。所用序列如下：Rab13 siRNA，5’-CAUCJUAAGUGCUCUUGAAGtt-3’，5'-CUUCAACAGCACUUACACCtt-3'；对照组sjRNA，5 ’-AGGAGAUGJUGAUAUUGGCUtt-3 ’，5 ’-AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt-3’。BLAST排除与其他基因序列的同源性。于培养第4d进行siRNA转染：在Opti-MEM中混匀siRNA及Re-boJuice转染试剂，根据预实验及培养密度确定siRNA浓度(TER测定实验150 nmol/L， Western及细胞染色100 nmol/L)：转染24 h后更换正常无血清培养液，继续培养48 h后收集细胞。
1.3.7 统计学分析
本研究中所涉及TER及Western印迹等实验结果采用GB-STAT分析软件(版本7.0； Dy-namlc microsystems)进行双因素方差分析及Dun-nett's检验，P<0.05为差异显著，P, http://www.100md.com(宿文辉 孟晓娜 贾晓宇)