牛乳腺上皮细胞体外培养条件的优化及功能验证(1)
摘要：乳腺上皮细胞是研究泌乳的调控机理、乳腺癌发病机制以及制备乳腺生物反应器靶细胞。由于乳腺细胞体外培养生命周期较短并且增殖活力与体外培养时间呈负相关，到目前为止，能够适合体外研究的乳腺细胞系报道较少。因此，在优化了乳腺细胞体外培养条件的基础上，进一步验证了优化体系后培养的乳腺上皮细胞生物学的稳定性、蛋白表达情况及转基因的效率。结果表明：1：1DMEM/F12基础培养液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生长因子+10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰岛素+0.1mmol/L非必须氨基酸是维持乳腺上皮细胞体外培养的最适条件。在此培养条件获得的乳腺上皮细胞生长旺盛，传代次数能延长到20代，生长后期仍然能稳定表达CK18，且具有较高的转基因效率.
关键词：乳腺细胞；体外培养；转基因；乳腺生物反应器
中图分类号：Q2-0文献标识码：A文章编号：1007-7847(2015)01-0019-05
Optimization of Culture Condition and Functional Verification for Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro
HE Xiao-ying*，MA Li-bing，CHENG Teng，LIU Xi-yu，LIU Juan，WU Fei
(School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 104010，Inner Mongolia，China)
Abstract：Mammary epithelia cells are an important invitro model to study the mechanism of lactation，cancer and mammary bioreactor.However，it is very hard to culture in vitro.Currently，fewer cell lines have been used in mammary research field.A valid method for the study of the mammary gland epithelium cell was established.The results showed that the media added 1：1 DMEM/F12，plus 10% FBS，2 mmol/L L-glu-tamine，10ng/mL EGF，10ng/mL FGF，10(xg/mL ITS，5μg/mL insulin and 0.1 mmol/L NAEE was the suitable media for bovine mammary epithelial cells.The mammary epithelia cells obtained under optimized condition grew vigorous，extended life span to 20 passages，steadily expressed CK18 and had high transgenic efficiency.
Keywords：mammarycells；invitroculture；transgene；mammarybioreactor(LifeScienceResearch，2015，19(1)：019-023)
乳腺细胞是研究泌乳的调控机理、乳腺癌疾病模型、乳腺生物反应器制备转基因动物等领域的靶细胞。到目前为止，由于乳腺上皮细胞是一种高度分化的细胞，体外培养较为困难。尽管现在已经建立了一些永生化的牛乳腺细胞系，但是，这些细胞系除了MAC-T外[1]，其他细胞系还没有得到别的学者检验及进一步的相关研究，而且乳腺上皮细胞体外培养的体系也不完善，当采用外源基因导人体外培养的细胞方法来分析基因功能或转基因动物研究时，要求乳腺上皮细胞能长时间地体外稳定生长。此外，在培养过程中由于培养环境的局限性，影响了细胞的正常生长，进而导致调控细胞凋亡等的信号通路发生改变，加速了细胞的死亡，这样也局限了正常乳腺细胞的体外研究[2]。因此，探索牛乳腺细胞体外培养条件是该领域研究的迫切需要。本研究旨在研究牛乳腺上皮细胞体外分离培养的最适条件，在此基础上，进一步验证优化体系后培养的乳腺上皮细胞生物学稳定性、蛋白表达及转基因的效率高低。
1材料与方法
1.1材料和试剂
新鲜乳腺组织取自屠宰场。质粒纯化试剂盒说明书(EndofreePlasmidExtractionKit)购自Promega公司(美国)；脂质体2000、1：1DMEM/F12基础培养液、非必需氨基(NEAA)、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素蛋白转铁硒纳(100x)(ITS)和膜岛素(Insulin)购自Invitrogen公司(美国)，单克隆鼠抗角蛋白CK18、羊抗小鼠IgG-cy3二抗和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Hoechst33342、100U/mL青霉素、100(xg/mL链霉素和谷氨酰胺购自Sigma公司(美国)。真核表达载体pEGFP-Cl购自Clontech公司(美国)；宿主菌DH5a为本室保存。
1.2方法
1.2.1乳腺上皮细胞的分离与培养
无菌状态下取健康牛乳腺组织，采用PBS液清洗3?5遍，用眼科镊剪成1mm3小块，将其贴于培养肌中，间距0.5cm左右，倒置培养皿，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱大约2～3h左右。待组织块与培养皿粘合牢固时，补足培养液，每隔3d换一次液持续培养，大约10?14d上皮养细胞迁出。待乳腺上皮细胞达90%汇合后，去除培养液，PBS清洗两遍，加入0.25%胰酶0.04%EDTA消化8min，待胞质回缩变圆，加入等量的含有血清的基础培养液终止消化，收集细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，加入培养液制成细胞悬液，按1：3的比例接种在新的培养皿中，37℃，5%CO2，饱和湿度下继续培养。, http://www.100md.com(贺小英 马利兵 程腾 刘希宇 刘销 吴飞)
关键词：乳腺细胞；体外培养；转基因；乳腺生物反应器
中图分类号：Q2-0文献标识码：A文章编号：1007-7847(2015)01-0019-05
Optimization of Culture Condition and Functional Verification for Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro
HE Xiao-ying*，MA Li-bing，CHENG Teng，LIU Xi-yu，LIU Juan，WU Fei
(School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 104010，Inner Mongolia，China)
Abstract：Mammary epithelia cells are an important invitro model to study the mechanism of lactation，cancer and mammary bioreactor.However，it is very hard to culture in vitro.Currently，fewer cell lines have been used in mammary research field.A valid method for the study of the mammary gland epithelium cell was established.The results showed that the media added 1：1 DMEM/F12，plus 10% FBS，2 mmol/L L-glu-tamine，10ng/mL EGF，10ng/mL FGF，10(xg/mL ITS，5μg/mL insulin and 0.1 mmol/L NAEE was the suitable media for bovine mammary epithelial cells.The mammary epithelia cells obtained under optimized condition grew vigorous，extended life span to 20 passages，steadily expressed CK18 and had high transgenic efficiency.
Keywords：mammarycells；invitroculture；transgene；mammarybioreactor(LifeScienceResearch，2015，19(1)：019-023)
乳腺细胞是研究泌乳的调控机理、乳腺癌疾病模型、乳腺生物反应器制备转基因动物等领域的靶细胞。到目前为止，由于乳腺上皮细胞是一种高度分化的细胞，体外培养较为困难。尽管现在已经建立了一些永生化的牛乳腺细胞系，但是，这些细胞系除了MAC-T外[1]，其他细胞系还没有得到别的学者检验及进一步的相关研究，而且乳腺上皮细胞体外培养的体系也不完善，当采用外源基因导人体外培养的细胞方法来分析基因功能或转基因动物研究时，要求乳腺上皮细胞能长时间地体外稳定生长。此外，在培养过程中由于培养环境的局限性，影响了细胞的正常生长，进而导致调控细胞凋亡等的信号通路发生改变，加速了细胞的死亡，这样也局限了正常乳腺细胞的体外研究[2]。因此，探索牛乳腺细胞体外培养条件是该领域研究的迫切需要。本研究旨在研究牛乳腺上皮细胞体外分离培养的最适条件，在此基础上，进一步验证优化体系后培养的乳腺上皮细胞生物学稳定性、蛋白表达及转基因的效率高低。
1材料与方法
1.1材料和试剂
新鲜乳腺组织取自屠宰场。质粒纯化试剂盒说明书(EndofreePlasmidExtractionKit)购自Promega公司(美国)；脂质体2000、1：1DMEM/F12基础培养液、非必需氨基(NEAA)、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素蛋白转铁硒纳(100x)(ITS)和膜岛素(Insulin)购自Invitrogen公司(美国)，单克隆鼠抗角蛋白CK18、羊抗小鼠IgG-cy3二抗和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Hoechst33342、100U/mL青霉素、100(xg/mL链霉素和谷氨酰胺购自Sigma公司(美国)。真核表达载体pEGFP-Cl购自Clontech公司(美国)；宿主菌DH5a为本室保存。
1.2方法
1.2.1乳腺上皮细胞的分离与培养
无菌状态下取健康牛乳腺组织，采用PBS液清洗3?5遍，用眼科镊剪成1mm3小块，将其贴于培养肌中，间距0.5cm左右，倒置培养皿，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱大约2～3h左右。待组织块与培养皿粘合牢固时，补足培养液，每隔3d换一次液持续培养，大约10?14d上皮养细胞迁出。待乳腺上皮细胞达90%汇合后，去除培养液，PBS清洗两遍，加入0.25%胰酶0.04%EDTA消化8min，待胞质回缩变圆，加入等量的含有血清的基础培养液终止消化，收集细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，加入培养液制成细胞悬液，按1：3的比例接种在新的培养皿中，37℃，5%CO2，饱和湿度下继续培养。, http://www.100md.com(贺小英 马利兵 程腾 刘希宇 刘销 吴飞)