另一个提高该系统特异性的方法是使用成对的切口酶，在Cas9的RuvC或NHN核酸酶位点引入DlOA或H840A的突变[42] ，形成只切割靶DNA一条链的Cas9切口酶，并且这种酶在某些位点引起的HR基因修复的几率要大于NHEJc'5， 161。使用两个gRNAs和Cas9切口酶在靶位点的临近区域产生两个切口[27，43，44]，可以有效地产生缺失突变，该种方法已经被许多研究应用。由于单个Cas9切口酶也可以在特定的基因位点产生插入缺失突变，因此在基因编辑时为使两个切口酶互相“依赖”于对方，即一个切口酶只有在与另一个切口酶靠得很近时才会有基因编辑的能力，可将一个形成二聚体时才有活性的核酸酶例如FokI融合到无核酸酶活性的dCas9上[45，46] 那么当两个dCas9-gRNA聚合在一起时就可以产生二聚体Fokl ......