滋肾化瘀祛痰汤对多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗相关性的影响研究(1)
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【摘要】目的:观察滋肾化瘀祛痰汤对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠胰岛素抵抗相关性的影响并分析其可能的作用机制。方法:规律发情周期SD雌性大鼠50只,应用人绒毛膜促性腺激素(HCG)联合胰岛素(INS)造模法制作动物模型,随机分为正常对照组、模型对照组、二甲双胍组、滋肾化瘀祛痰汤组和益肾导痰调冲汤组。运用放免法测定血清性激素水平的变化,光镜观察卵巢组织形态学改变,免疫组化法检测卵巢组织INR和IGF-1R表达水平。结果:滋肾化瘀祛痰汤能使PCOS大鼠卵巢囊状卵泡减少,颗粒细胞形态恢复完整、排列整齐,卵泡膜细胞层变厚,黄体组织增多;血清T、FSH、LH、INS水平明显下降(P<0.05),并下调卵巢组织IGF-1R,增高INR表达。结论:滋肾化瘀祛痰汤通过调整内分泌及影响IGF-1R及INR的表达,改善PCOS大鼠的高胰岛素血症和胰岛素抵抗,促进卵泡的发育成熟及排卵。
【关键词】滋肾化瘀祛痰汤;多囊卵巢综合征大鼠;胰岛素抵抗;高胰岛素血症
【中图分类号】R285.6【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-037-3
多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女常见的一种发病多因性,临床表现呈多态性的异质性内分泌紊乱疾病。据报道,PCOS在育龄妇女中的发病率为6%～10%,是造成不孕的重要原因之一,占无排卵性不育病因的50～70%[1]。中医学中无“多囊卵巢综合征”病名,根据其主要临床表现当属祖国医学“月经后期”、“闭经”或“崩漏”、“不孕”等范畴。现代中医治疗多囊卵巢综合征多采用辨病与辨证相结合,本实验所用方药是以滋肾阴为主,兼祛瘀化痰,调理冲任为治则创立的治疗肾阴虚痰瘀互阻型PCOS的有效方剂,临床中多用于PCOS中偏于高胰岛素血症和胰岛素抵抗型的患者。本实验运用放射免疫、免疫组化等技术,观察中药滋肾化瘀祛痰汤对PCOS大鼠内分泌、卵巢形态学及其IR改善情况的影响;重点研究IGF-1R、胰岛素受体(INR)在卵巢的表达,以从细胞分子学水平探讨其对PCOS胰岛素抵抗的作用,为滋肾化瘀祛痰汤的临床应用提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物选用6-7周龄的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠。SPF级,由温州医学院实验动物中心提供和饲养。每日光照12小时,喂以大鼠颗粒饲料。
1.1.2药品与试剂①滋肾化瘀祛痰汤、益肾导痰调冲汤:由温州中山医院中国中西医结合学会生殖医学不孕不育研究所提供、制备,4～10℃保存待用。②二甲双胍片:0.25g/片,贵州天安药业。③中性胰岛素注射液:10ml:400单位,江苏万邦生化医药股份有限公司。④注射用人绒毛膜促性腺激素:注射用绒促性素1000IU/瓶,丽珠集团丽珠制药厂。⑤血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、胰岛素(INS)放免试剂盒,博士德生物工程有限公司产品。⑥INR、IGF-1R免疫组化试剂盒:博士德生物工程有限公司产品。
1.2方法
1.2.1模型制备及分组
SD大鼠,雌性,体重180～200克(6～7周龄),进行阴道涂片确定规律发情周期;两周后,选择规律发情周期大鼠50只,体重240～260克(8～9周龄),随机分为正常对照组(n=10)和病理模型组(n=40)。正常对照组第1～10天皮下注射生理盐水0.2ml,每日一次;第11～22天皮下注射生理盐水0.2ml,每日两次。采用Poretsky造模法[2],制作PCOS大鼠模型。病理模型组第1～10天股骨内侧皮下注射中性胰岛素注射液(溶于生理盐水共0.2ml),每日一次,由0.5IU递增至6.0IU(表1);第11～22天持续6.0IU剂量;同时第11～22天皮下注射HCG3IU(溶于生理盐水共0.2ml),每日两次,实验周期为22天。所有实验动物给予自然光照及自由饮食饮水(处理前为普通饮用水,处理期间为5%葡萄糖水),并继续每日进行阴道涂片以监测发情周期。
1.2.2给药方法
造模完成后将上述病理模型组(n=40)又随机分为模型对照组(n=10)、二甲双胍组(n=10)、滋肾化瘀祛痰汤组(n=10)、益肾导痰调冲汤组(n=10),第23天开始分别灌胃予对应剂量的药物。在给药剂量上按人鼠体重比换算后乘以人与大鼠体重换算系数6.25,换算后大鼠给药量为:二甲双胍组0.16g/kg·d;滋肾化瘀祛痰汤中剂量组(两倍量)46.90g/kg·d;益肾导痰调冲汤中剂量组47.92g/kg·d;而正常对照组与模型对照组给予生理盐水10ml/kg·d,连续灌胃14天后处死。正常对照组和模型对照组与两中药组比较,观察中药疗效;正常对照组与模型对照组比较,观察造模情况。并继续每日进行阴道涂片以监测发情周期。
1.2.3检测项目及方法
(1)卵巢组织病理检查:大鼠经戊巴比妥钠麻醉后取出双侧卵巢,修剪后将卵巢以其长径剖开,10%甲醛溶液常温固定24小时以上,送病理科石蜡包埋。以卵巢最大平面作为待检平面切片,分别以4μm厚度切片两次(间隔40μm)。
(2)激素检测:心脏取血,3000r/min离心10min,收集血清样品,-20℃保存,应用放射免疫法(RIA)测定血清中卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、和INS的含量。
(3)免疫组化分析:应用SABC法分析卵巢组织中INR和IGF-1R的表达,1.2.4应用SPSS11.5统计软件进行方差分析。
2结果
2.1卵巢病理检查肉眼观察:正常对照组卵巢色泽红润;模型对照组卵巢表面较苍白,体积增大,见较多囊状扩张的卵泡;两中药组卵巢色泽较模型对照组红润;二甲双胍组与模型对照组无差异。镜下观察:正常对照组可见不同发育阶段卵泡及多个黄体,无囊性卵泡出现;颗粒细胞形态完整,排列整齐,卵泡膜无显著增生。模型对照组及二甲双胍组标本中可见囊性扩张卵泡,窦腔扩大,放射冠消失;颗粒细胞层数减少排列稀疏,卵泡膜细胞显著增生及间质细胞增生。两中药组囊状卵泡明显减少;颗粒细胞层数较模型对照组明显增多,颗粒细胞形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞层变薄,黄体组织数量增多。滋肾化瘀祛痰汤组较益肾导痰调冲汤组改善更明显。
2.2血清激素的测定模型对照组血清T、FSH、LH、INS较正常对照组明显升高(P<0.05);滋肾化瘀祛痰汤组血清T、FSH、LH、INS和二甲双胍组、益肾导痰调冲汤组血清T、LH、INS较模型对照组明显降低(P<0.05);各组间血清E2均无显著性差异。(表1)
2.3卵巢组织IGF-1R和INR的表达模型对照组颗粒细胞IGF-1R表达明显强于正常对照组(P<0.05),两中药组IGF-1R表达较模型对照组明显降低(P<0.05),二甲双胍组与模型对照组间、两中药组间无显著性差异。模型对照组INR表达明显低于正常对照组(P<0.05),滋肾化瘀祛痰汤组较模型对照组、益肾导痰调冲组均明显增高(P<0.05),二甲双胍组、益肾导痰调冲汤组与模型对照组间均无显著性差异 ......
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