大果木姜子不同组方提取物体外抗菌试验研究
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2010年9月1日
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【摘要】目的:以体外药物的抗菌强度为测评指标,把以大果木姜子精油为主药与其他抗菌药物组成的Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号三个处方进行优选,确定最佳的处方组成和提取方法。方法:采用琼脂扩散管碟法定性、试管法定量对三个处方水提物及醇提物的体外抗菌强度进行测定比较。结果:Ⅲ号处方的醇提液具有较好的体外杀菌作用。
【关键词】大果木姜子;不同组方;体外抗菌试验
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)18-042-2
大果木姜子(Cinnamomum migao H.W.Li)系樟科樟属植物米槁的干燥果实,是贵州十大苗药之一。根据有关文献资料[1～8]及其预试验的情况,证明大果木姜子精油为其主要成分,具有明显的体外体内抗菌、抗病毒、杀虫等功效。为更好地发挥其体外抗菌的疗效,我们结合现代药理的结果,以大果木姜子精油为主药与其他抗菌药物组成的Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号三个处方,采用水提、醇提两种工艺对其体外抗菌强度进行了测定。现将试验结果报告如下。
1试验药物的制备及使用的设备
配方以大果木姜子精油为主,分别配伍:珊瑚姜;杠板归;飞龙掌血;苦参;土荆皮;蛇床子;花椒等药物的提取物组成Ⅰ～Ⅲ号方,分别采用醇提和水提工艺制备出①～⑥号试验药物。
①③⑤号试验药物:取十分之一量Ⅰ～Ⅲ号处方,分别用70%的乙醇加热回流提取两次,第一次加醇6倍量,提取1小时;第二次加醇6倍量,提取1小时,提取液合并,挥至无醇味,过滤,用蒸馏水定容至100ml(即每毫升药液中含生药材0.4g),静置24小时,过滤;另取大果木姜子精油1g加入0.5%吐温-80(即0.5g)增溶剂,超生5min混匀,混合液2000r/min离心10min,取上清夜,备用。
②④⑥号试验药物制备:取十分之一量Ⅰ～Ⅲ号方,用水煎煮两次,第一次加水10倍量,煎煮1小时;第二次加水8倍量,煎煮1小时,煎液合并,浓缩定容至100ml(即每毫升药液中含生药材0.4g)静置24小时,过滤;另取大果木姜子精油1g加入0.5%吐温-80(即0.5g)增溶剂,加入水提取液中超生5min混匀,混合液2000r/min离心10min,取上清夜,备用。
通过以上工艺制备六个试验制剂样品,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,放于4℃冰箱中,备用。
注:各处方十分之一量为40g生药,其中大果木姜子按出油率为20%计算。
2菌种及培养基
2.1试验菌种金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、绿脓杆菌、絮状表皮癣菌、黄曲霉菌、白色念珠菌。(均来自贵阳中医学院微生物教研室)
2.2培养基本试验采用普通牛肉汤培养基、普通营养琼脂、血琼脂平板、虎红培养基、沙氏液体培养基、沙氏琼脂等。
3试验方法
3.1细菌的处理方法
3.1.1细菌将菌种接种于普通琼脂斜面培养基上,置恒温培养箱37℃培养48h,再接种于肉汤培养基,于37℃培养6-8h,然后作1:1000稀释备用。
3.1.2真菌用72小时培养物洗脱的真菌孢子悬液调整浓度为5×105个/ml备用。
3.2抗菌强度定性试验
按抗生素的效价测定(管碟法)操作,取无菌培养皿(直径90mm,高18mm大小一致,皿底平坦)20套,每皿加入融化的15ml普通琼脂培养基作为底层,凝固。将融化并冷却至50-60℃的普通琼脂培养基100ml加入50%葡萄糖液1ml和菌液2ml充分混匀,立即取5ml均匀平铺在已凝固的底层培养基上,凝固成上层培养基。每个培养皿块等距离按置3个已灭菌牛津杯,取已灭菌枪头用微量移液枪将100u1各处方提取液加入到牛津杯中,置37℃恒温箱培养24h,用游标卡尺测量其抑菌圈直径。生理盐水做阴性对照。
3.3抗菌强度定量试验
本试验采用试管法定量测定药物的抗菌强度。每一菌株取干净试管10支,于第1管加入上述100%浓度药液和相应培养液1毫升,第2管至第8管各加入相应培养液1毫升。将第1管中药液混匀后沿2～8管做等倍稀释,至第8管混匀后吸取1毫升弃去,由此得到1:2、1:4、1:8……1:256的稀释度。第9管只加稀释菌液或孢子悬液1.05毫升作阳性对照,第10管只加相应培养液1.05毫升作阴性对照。分别吸取稀释菌液或孢子悬液0.05毫升加入第1管至第8管,混匀。
细菌:以无药MH肉汤培养基接种相同菌种作为对照,于37℃恒温箱培养24h后,以有无菌生长为判断标准,与对照组(菌落生长正常)比较,有肉眼可见菌落生长者为无抑菌作用,无菌落生长者的药物最低浓度为药物的(MIC);真菌:以无药沙氏液体培养基接种相同菌种作为对照,于25℃恒温箱培养72h后,以有无菌生长为判断标准,与对照组(菌落生长正常)比较,有肉眼可见菌落生长者为无抑菌作用,无菌落生长者的药物最低浓度为药物的(MIC)。每个浓度的药物抑菌试验重复3次,抑菌结果为3次试验平均值。
细菌经常规培养24小时后观察MIC,转种琼脂平板观察MBC;真菌经常规培养72小时后观察结果MIC,转种虎红琼脂后观察MBC。
4结果与分析
4.1抗菌强度定性试验结果见表一。
4.2抗菌强度定性试验结果见表二。
5试验结论
为进一步优选其处方及工艺,考察其药效,我们采用琼脂扩散管碟法定性、试管法定量对大果木姜子精油,通过琼脂扩散管碟法定性测定证明③号醇提液对乙型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、絮状表皮癣菌的抑菌圈半径最大,且除了黄曲霉菌外都有明显的抗菌作用;通过试管法定量测定也验证实其抗菌作用,且对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、表皮癣菌具有较好的体外杀菌作用 ......
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