藿香正气水微生物限度检查方法验证试验研究
【关键词】 藿香正气水；微生物限度检查
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】A 【文章编号】1007—8517(2013)18—0010—02
藿香正气水是由苍术、陈皮、厚朴(姜制)、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、广藿香油、紫苏叶油等十味组成，具有解表化湿，理气和中的功效。用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒，证见头痛昏重、胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻。在药品检验中，为保证微生物限度检查方法的科学性及准确性，根据《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查方法的验证，以保证所采用的检验方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌计数的测定和控制菌检查。按照《中国药典》2010年版的规定对3批藿香正气水微生物限度检查法的试验进行研究，结果报道如下。
1 材料
1.1 培养基营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、MUG培养基、EMB培养基。
, http://www.100md.com
1.2 供试品 藿香正气水(批号：20110601、20110602、20110603)。
1.3 菌种大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉〔CM-CC(F)98003〕，均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 菌液制备将上述5株菌的新鲜培养物分别接种至规定培养基中，细菌培养2天，酵母菌培养24h，霉菌培养5天，制备成菌(孢子)悬液，备用。
2.2 供试液制备按规定量取供试品10ml，置无菌锥形瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，充分振荡使供试品分散均匀，即为1：10供试液，备用。
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2.3 细菌计数、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 试验组取供试液(1：10)1ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，在最后一次冲洗液中加入50～100cfu各试验菌，过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验品平行制备2个平皿按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
2.3.2 菌液组取菌液50～100cfu过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验菌平行制备2个平皿，按照《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
2.3.3 供试品对照组取供试液(1：10)1ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验品平行制备2个平皿按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
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2.3.4 稀释剂对照组用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液1ml代替供试液，其它方法同试验验组操作、培养，计数，即得。
2.5 回收率回收率%=(试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。
2.6 结果判断在3次平行试验中，试验组的菌回收率均应在70%以上，该验证方法可用于试验；若低70%，应采用适宜的方法消除供试品的抑菌活性，重新进行验证试验。
2.7 预试验取1：10供试液1ml/mL、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/Jg、O.1ml/皿分别注1皿为一组，每组加入1种试验菌菌液，共5组。大肠埃希菌白色念珠菌1ml/皿、O.5ml/皿、O.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分别为0、2、16、2l、35%，金黄色葡萄球菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、O.1ml/皿的回收率分别为3、5、10、12、20%，枯草芽孢杆菌的回收率分别为0、3、15、23、27%，白色念珠菌的回收率分别为13、10、19、29、34%，黑曲霉的回收率分别为4、11、16、22、35%.根据以上预试验结果来看，回收率低于70%，证明该品种具有较强的抑菌活性能力，应重新采用适宜的方法除菌处理后，进行验证。根据上述结果来看，该品种验证方法推向薄膜过滤法试验，试验结果见表1。
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2.8 控制菌检查法的验证
2.8.1 大肠埃希菌检查试验组取1：10供试液10ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗二次，过滤，将滤膜取放入装有100ml胆盐乳糖培养基中，再加入10～100cfu大肠埃希菌，摇匀，按照《中国药典》2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法进行培养、观察，即得。阴性菌对照组方法同试验组，以金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌。供试品1：10供试液10ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，过滤，将滤膜取放入装有100ml胆盐乳糖培养基中，摇匀，按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、观察，即得。
2.8.2 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌；试验组应检出试验菌，该试验方法成立。
2.8.3 控制菌检查方法验证大肠埃希菌采用培养基稀释法验证，试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性菌对照菌。
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2.9 结果采用经验证的方法检查3批藿香正气水，细菌数均小于10cfu/g，霉菌及酵母菌均小于10cfu/g，未检出大肠埃希菌。
3 讨论
根据预试验结果，采用常规法1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1皿/供试液量进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的计数验证，3个批号试验组的数据中，均出现个别平皿回收菌数与同组数据相差太大，甚至有0回收的现象；将供试液的量制备成1：20供试液0.5ml/皿、0.2ml/皿/以降低供试液的抑菌活性，上述现象未能完全消除；最终将细菌检查采用1：10供试液薄膜过滤法，该方法对细菌、霉菌及酵母菌进行计数验证，同组之间各皿数值趋于一致。
藿香正气水处方中的部分原辅料及乙醇具有较强的抑菌活性成分。供试品为口服剂，检验取样时难以保证同一试验组各个平皿中绝对均匀，对试验菌的回收造成直接的影响。一般情况下，验证试验方法的选择——预试验，可以在较小工作量的前提下，为正式试验提供一个合理、可行的试验方法。但藿香正气水的金黄色葡萄球菌预试验，对同一试验组中可能出现个别平皿回收菌数大大低于同组其它平皿回收菌数的异常现象是不能估计与预计的。
经验证确认，生产企业在原辅料、生产工艺、检验及处方等条件不变的情况下，藿香正气水的微生物限度检查可按以下方法进行检验。细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证计数采用1：10供试液1ml薄膜过滤法，冲洗总量为300ml；控制菌大肠埃希菌采用1：10供试液10ml薄膜过滤法，冲洗总量为200ml验证，其它按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录.
(收稿日期：2013.07.29), http://www.100md.com(刘敏)
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】A 【文章编号】1007—8517(2013)18—0010—02
藿香正气水是由苍术、陈皮、厚朴(姜制)、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、广藿香油、紫苏叶油等十味组成，具有解表化湿，理气和中的功效。用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒，证见头痛昏重、胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻。在药品检验中，为保证微生物限度检查方法的科学性及准确性，根据《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查方法的验证，以保证所采用的检验方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌计数的测定和控制菌检查。按照《中国药典》2010年版的规定对3批藿香正气水微生物限度检查法的试验进行研究，结果报道如下。
1 材料
1.1 培养基营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、MUG培养基、EMB培养基。
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1.2 供试品 藿香正气水(批号：20110601、20110602、20110603)。
1.3 菌种大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉〔CM-CC(F)98003〕，均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 菌液制备将上述5株菌的新鲜培养物分别接种至规定培养基中，细菌培养2天，酵母菌培养24h，霉菌培养5天，制备成菌(孢子)悬液，备用。
2.2 供试液制备按规定量取供试品10ml，置无菌锥形瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，充分振荡使供试品分散均匀，即为1：10供试液，备用。
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2.3 细菌计数、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 试验组取供试液(1：10)1ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，在最后一次冲洗液中加入50～100cfu各试验菌，过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验品平行制备2个平皿按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
2.3.2 菌液组取菌液50～100cfu过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验菌平行制备2个平皿，按照《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
2.3.3 供试品对照组取供试液(1：10)1ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，过滤，将滤膜取出，菌面朝上，分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基上，每株试验品平行制备2个平皿按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、计数。
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2.3.4 稀释剂对照组用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液1ml代替供试液，其它方法同试验验组操作、培养，计数，即得。
2.5 回收率回收率%=(试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。
2.6 结果判断在3次平行试验中，试验组的菌回收率均应在70%以上，该验证方法可用于试验；若低70%，应采用适宜的方法消除供试品的抑菌活性，重新进行验证试验。
2.7 预试验取1：10供试液1ml/mL、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/Jg、O.1ml/皿分别注1皿为一组，每组加入1种试验菌菌液，共5组。大肠埃希菌白色念珠菌1ml/皿、O.5ml/皿、O.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分别为0、2、16、2l、35%，金黄色葡萄球菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、O.1ml/皿的回收率分别为3、5、10、12、20%，枯草芽孢杆菌的回收率分别为0、3、15、23、27%，白色念珠菌的回收率分别为13、10、19、29、34%，黑曲霉的回收率分别为4、11、16、22、35%.根据以上预试验结果来看，回收率低于70%，证明该品种具有较强的抑菌活性能力，应重新采用适宜的方法除菌处理后，进行验证。根据上述结果来看，该品种验证方法推向薄膜过滤法试验，试验结果见表1。
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2.8 控制菌检查法的验证
2.8.1 大肠埃希菌检查试验组取1：10供试液10ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗二次，过滤，将滤膜取放入装有100ml胆盐乳糖培养基中，再加入10～100cfu大肠埃希菌，摇匀，按照《中国药典》2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法进行培养、观察，即得。阴性菌对照组方法同试验组，以金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌。供试品1：10供试液10ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗三次，过滤，将滤膜取放入装有100ml胆盐乳糖培养基中，摇匀，按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法进行培养、观察，即得。
2.8.2 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌；试验组应检出试验菌，该试验方法成立。
2.8.3 控制菌检查方法验证大肠埃希菌采用培养基稀释法验证，试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性菌对照菌。
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2.9 结果采用经验证的方法检查3批藿香正气水，细菌数均小于10cfu/g，霉菌及酵母菌均小于10cfu/g，未检出大肠埃希菌。
3 讨论
根据预试验结果，采用常规法1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1皿/供试液量进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的计数验证，3个批号试验组的数据中，均出现个别平皿回收菌数与同组数据相差太大，甚至有0回收的现象；将供试液的量制备成1：20供试液0.5ml/皿、0.2ml/皿/以降低供试液的抑菌活性，上述现象未能完全消除；最终将细菌检查采用1：10供试液薄膜过滤法，该方法对细菌、霉菌及酵母菌进行计数验证，同组之间各皿数值趋于一致。
藿香正气水处方中的部分原辅料及乙醇具有较强的抑菌活性成分。供试品为口服剂，检验取样时难以保证同一试验组各个平皿中绝对均匀，对试验菌的回收造成直接的影响。一般情况下，验证试验方法的选择——预试验，可以在较小工作量的前提下，为正式试验提供一个合理、可行的试验方法。但藿香正气水的金黄色葡萄球菌预试验，对同一试验组中可能出现个别平皿回收菌数大大低于同组其它平皿回收菌数的异常现象是不能估计与预计的。
经验证确认，生产企业在原辅料、生产工艺、检验及处方等条件不变的情况下，藿香正气水的微生物限度检查可按以下方法进行检验。细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证计数采用1：10供试液1ml薄膜过滤法，冲洗总量为300ml；控制菌大肠埃希菌采用1：10供试液10ml薄膜过滤法，冲洗总量为200ml验证，其它按照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录.
(收稿日期：2013.07.29), http://www.100md.com(刘敏)