加味通幽汤对缺氧条件下食管癌细胞血管生成拟态和增殖的影响(1)
【摘 要】 目的：观察加味通幽汤对缺氧导致的食管癌细胞血管生成拟态(VM)形态学和细胞增殖的影响。方法：缺氧环境培养Eca109细胞，镜下观察细胞VM，以加味通幽汤含药大鼠血清干预细胞，观察其对VM形态的影响，CCK8法检测方药对细胞增殖的影响。结果：常氧对照组细胞形态成团状且无规律；含药血清常氧组细胞分散，出现凋亡；缺氧对照组细胞相互连接呈管状；含药血清治疗组细胞成团块状并且出现凋亡。CCK8细胞增殖实验显示，含药血清治疗组明显低于其他3组(P=0.000)。结论：加味通幽汤可改善食管癌细胞VM形态变化，并抑制缺氧环境下的细胞增殖。
【关键词】 食管癌；Eca109细胞；加味通幽汤；血管生成拟态
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2018)08-0023-04
Abstract：Objective To observe effectof Modified Tongyou Decoction (MTD) onvasculogenic mimicry (VM) morphology and cell proliferation of esophageal squamous carcinoma cellunder hypoxic conditions.Methods Eca109 cells were cultured in hypoxia environment， vasculogenic mimicry was observed through microscope. Rats’ serum with MTDwas taken into culture medium， VMmorphology was observed and cell proliferation was determined with CCK8 assay.Results Cells in the controlled group shape of cells were colony and irregular； cells were scatteredin the medicated-serumcontrolled group， apoptosis emerging； however， cells were connected with each other in hypoxia group cell with fusion of tubulous structure； cells in the medicated-serum treatment group were mass clumps and apoptosis also occurred. Proliferation ratio in the medicated serum treatment group was significantly lower than that in the other 3 groups(P=0.000).Conclusion Under hypoxia conditions，MTD shows significant effect on VM andproliferationof Eca109 cells .
Keywords：Esophageal Cancer； Eca109 cell； Modified Tongyou Decoction； Vasculogenic Mimicry
在世界范围内，我国的食管癌发病率和死亡率均位居各国之首。我国的食管癌病理类型以鳞癌为主，约占食管癌总数的95%左右。食管鳞癌具有进展迅速、早期转移等特点，绝大多数患者在发现时已处于中晚期，局部复发和远处转移较多，总体预后较差，严重危害人们健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在对人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中发现了血管生成拟态(vasculogenic mimicry， VM)，血管生成拟态是对传统肿瘤血管生成理论的补充。肿瘤增生过快造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧和代谢紊乱状态，这是恶性肿瘤的生长特点之一。研究表明缺氧可触发机体产生一系列应激性保护反应。肿瘤细胞在没有内皮细胞的参与下，表型出现转化，通过自身变形和基质重塑直接形成特有的微循环管道，这种管道能够执行微血管功能，部分弥补了因为血管新生滞后于瘤体生长所造成的氧和营养供给的缺乏，促进肿瘤迅速增长[4-7]。
食管癌在中医属于“噎膈”范畴，“金元四大家”之一李东垣所著《兰室秘藏》记载有“通幽汤”，是治疗瘀血内结，浊气不降之噎膈[8]的代表方，笔者结合中药药理研究成果[9-14]，创制加味通幽汤，获得国家发明专利(ZL201110308544.0)，全方由桃仁、红花、升麻、槟榔、半枝莲和白花蛇舌草6味中药组成。方中活血化瘀药桃仁、红花与行气散结药升麻、槟榔抑瘤效果显著；半枝莲、白花蛇舌草中含有的黄酮类、总多糖、皂苷等具有显著的抑瘤和促凋亡作用，临床广泛应用于包括食管癌在内的多种实体肿瘤。本研究观察了加味通幽汤对缺氧条件下食管癌Eca109细胞VM形态和细胞增殖的影响。
1 材料
1.1 动物及细胞株 4～6周龄SD雄性大鼠，体重200～400 g，清洁级，购于中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心，合格证号SCXK-(军)2014-0001。人食管癌 Eca109 細胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.2 药物与试剂 加味通幽汤(桃仁5 g，红花15 g，升麻10 g，槟榔5 g，半枝莲15 g，白花蛇舌草15 g)，各单味药物均购于北京同仁堂唐山连锁药店。
新生牛血清(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，1640培养基(CORNING公司)，PBS缓冲液(BI公司)，10%水合氯醛，Matrigel胶，CCK8(Amersco公司)，10×CoCl2(Sigma公司)，Milli-Q水(Milli-pore公司Milli-Q超纯水设备生产)。, 百拇医药(李英红 陈皓 刘欣然 陈玉玲魏堰翀肖港平贾永森)
【关键词】 食管癌；Eca109细胞；加味通幽汤；血管生成拟态
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2018)08-0023-04
Abstract：Objective To observe effectof Modified Tongyou Decoction (MTD) onvasculogenic mimicry (VM) morphology and cell proliferation of esophageal squamous carcinoma cellunder hypoxic conditions.Methods Eca109 cells were cultured in hypoxia environment， vasculogenic mimicry was observed through microscope. Rats’ serum with MTDwas taken into culture medium， VMmorphology was observed and cell proliferation was determined with CCK8 assay.Results Cells in the controlled group shape of cells were colony and irregular； cells were scatteredin the medicated-serumcontrolled group， apoptosis emerging； however， cells were connected with each other in hypoxia group cell with fusion of tubulous structure； cells in the medicated-serum treatment group were mass clumps and apoptosis also occurred. Proliferation ratio in the medicated serum treatment group was significantly lower than that in the other 3 groups(P=0.000).Conclusion Under hypoxia conditions，MTD shows significant effect on VM andproliferationof Eca109 cells .
Keywords：Esophageal Cancer； Eca109 cell； Modified Tongyou Decoction； Vasculogenic Mimicry
在世界范围内，我国的食管癌发病率和死亡率均位居各国之首。我国的食管癌病理类型以鳞癌为主，约占食管癌总数的95%左右。食管鳞癌具有进展迅速、早期转移等特点，绝大多数患者在发现时已处于中晚期，局部复发和远处转移较多，总体预后较差，严重危害人们健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在对人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中发现了血管生成拟态(vasculogenic mimicry， VM)，血管生成拟态是对传统肿瘤血管生成理论的补充。肿瘤增生过快造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧和代谢紊乱状态，这是恶性肿瘤的生长特点之一。研究表明缺氧可触发机体产生一系列应激性保护反应。肿瘤细胞在没有内皮细胞的参与下，表型出现转化，通过自身变形和基质重塑直接形成特有的微循环管道，这种管道能够执行微血管功能，部分弥补了因为血管新生滞后于瘤体生长所造成的氧和营养供给的缺乏，促进肿瘤迅速增长[4-7]。
食管癌在中医属于“噎膈”范畴，“金元四大家”之一李东垣所著《兰室秘藏》记载有“通幽汤”，是治疗瘀血内结，浊气不降之噎膈[8]的代表方，笔者结合中药药理研究成果[9-14]，创制加味通幽汤，获得国家发明专利(ZL201110308544.0)，全方由桃仁、红花、升麻、槟榔、半枝莲和白花蛇舌草6味中药组成。方中活血化瘀药桃仁、红花与行气散结药升麻、槟榔抑瘤效果显著；半枝莲、白花蛇舌草中含有的黄酮类、总多糖、皂苷等具有显著的抑瘤和促凋亡作用，临床广泛应用于包括食管癌在内的多种实体肿瘤。本研究观察了加味通幽汤对缺氧条件下食管癌Eca109细胞VM形态和细胞增殖的影响。
1 材料
1.1 动物及细胞株 4～6周龄SD雄性大鼠，体重200～400 g，清洁级，购于中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心，合格证号SCXK-(军)2014-0001。人食管癌 Eca109 細胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.2 药物与试剂 加味通幽汤(桃仁5 g，红花15 g，升麻10 g，槟榔5 g，半枝莲15 g，白花蛇舌草15 g)，各单味药物均购于北京同仁堂唐山连锁药店。
新生牛血清(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，1640培养基(CORNING公司)，PBS缓冲液(BI公司)，10%水合氯醛，Matrigel胶，CCK8(Amersco公司)，10×CoCl2(Sigma公司)，Milli-Q水(Milli-pore公司Milli-Q超纯水设备生产)。, 百拇医药(李英红 陈皓 刘欣然 陈玉玲魏堰翀肖港平贾永森)