大孔吸附树脂分离纯化鱼腥草总黄酮(2)
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取鱼腥草干品粗粉500g，根据作者已有经验L9(34)正交设计筛选出的鱼腥草总黄酮的乙醇浸提最优水平组合工艺：即采用70%乙醇、80℃温度、每次3h、提取3次进行提取制备，制得鱼腥草总黄酮提取液(总黄酮含量：6.86mg.mL-1)冷藏备用。
2.3 大孔吸附树脂的筛选4，5，6
将D3520型、AB-8型、NKA-9型、D4020型、S-8型树脂先用4倍体积量95%乙醇或丙酮浸洗数次每次24h，至浸洗液加适量水无白色浑浊现象止，用水反复清洗干净至无醇味，加入4倍体积量2mol.L-1的NaOH，浸泡12h，以水洗至中性；再加入4倍体积量4mol.L-1的HCl，浸泡12h，用水洗至中性后备用。
精密称取已预处理好的干树脂各3份，每份1g，置100mL三角瓶中，精密加入样品液20mL后于电动震荡机上，频率120次/min，间隔振摇2 h，然后静置20h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按下式计算树脂饱和吸附量：饱和吸附量＝(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积/树脂量(mg.g-1干树脂)，取3次平均值。将经静态饱和吸附总黄酮后树脂滤出，吸干表面水分，精密加入60%乙醇20mL后放于电动震荡机上，频率120次/min，间隔振摇2h后滤出，测定洗脱液黄酮的浓度，计算洗脱率：洗脱率＝(洗脱液浓度×洗脱液体积)/饱和吸附量×100%，取3次平均值。
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2.4 洗脱剂浓度对洗脱率的影响
精密称取处理好的AB-8型干树脂七份，每份1g，分别置100mL三角瓶中，精密加入20mL样品液后于电动震荡机上，按2.3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，分离树脂，吸干表面水分。对应加入浓度分别为30%，40%，60%、70%，80%，90%的乙醇20mL后于电动震荡机上，同法间隔振摇洗脱2h后滤出，测洗脱液中总黄酮浓度，按2.3项下公式计算洗脱率，取3次平均值。
2.5 pH对AB-8型树脂吸附量的影响
精密称取已预处理好的AB-8型干树脂各八份，每份1g，置100mL三角瓶中，精密加入pH 3，4，5，6，7，8，9，10样品液各20mL后于电动震荡机上，按2.3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按2.3项下公式计算树脂饱和吸附量，取3次平均值。
2.6 AB-8型树脂对鱼腥草总黄酮的动态吸附-洗脱性能试验4
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称取已处理好的AB-8型吸附树脂100g和20 g，分别湿法装入3cm×500cm的色谱柱中，将鱼腥草提取液350mL(6.86mg.mL-1)以2～3mL.min-1的流速上柱，过柱完后用3倍树脂体积量(3～4BV，下同)的水以3～4mL.min-1的速度洗柱至出水无色，再用4BV70%的乙醇以2～3mL.min-1的洗脱速度洗脱至无色透明，收集70%的乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，称重，测定总黄酮含量，计算动态吸附洗脱量。
2.7 上柱液浓度对AB-8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮的影响4
分别称取已处理好的AB-8型吸附树脂400g，3份，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏3份，每份100g(含总黄酮24.6g)，分别按2BV(1400mL)、3BV(2100mL)、4BV(2 800mL)加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL.min-1，过柱完后分别收集各自的过柱液，测其中总黄酮残留量。
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2.8 冲洗杂质用水量对AB-8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮影响
分别称取已处理好的AB-8型吸附树脂400g，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏2份，每份100g(含总黄酮24.6g)，分别按2BV(1400mL)加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL.min-1，过柱完后一份不冲洗，一份用1BV水(700mL)冲洗，共冲洗3次，分别测定每份过柱水中总黄酮残留量并计算损失量及考察水冲洗对总黄酮纯度影响。
2.9 洗脱剂洗脱次数对AB-8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮收率影响
称取已处理好的AB-8型吸附树脂400g，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏100g(含总黄酮24.6g)，按2BV(1400mL)加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL.min-1，过柱完后用70%乙醇作洗脱剂，按1BV(700mL)洗脱，共洗脱5次，收集每次洗脱剂，测定其中总黄酮含量。
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3 结果与分析
3.1 不同吸附树脂对鱼腥草总黄酮的静态吸附量及洗脱性能，结果见表1。
上述结果表明五种树脂对鱼腥草总黄酮的静态吸附量以S-8型稍高，AB-8型次之。在静态洗脱中，AB-8型树脂吸附的总黄酮较易洗脱，洗脱率远远高于其它4种，使总黄酮得到最大程度的回收，AB-8型树脂表现出最佳的综合性能。
3.2 洗脱剂浓度对AB-8型树脂饱和吸附后洗脱率的影响，结果见表2。
表2表明，70%～90%的乙醇洗脱率均在90%以上，考虑到节约成本及生产安全上的方便，本实验选用70%乙醇为洗脱剂。
3.3 pH对AB-8型树脂吸附量的影响，结果见表3。
表3表明，上样液以pH4～5吸附量大。黄酮类化合物多具酚羟基，显弱酸性，当上样液pH偏大时，鱼腥草总黄酮有离子化趋势而不易被吸附。因此，上样液pH值应约偏酸。
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3.4 AB-8型树脂对鱼腥草总黄酮的动态吸附-洗脱性能
根据静态试验结果，选用AB-8型树脂作为分离纯化鱼腥草总黄酮用树脂。70%乙醇为洗脱剂，用于鱼腥草总黄酮的动态吸附-洗脱，结果见表4。
表4表明，装柱量为100g的色谱柱总黄酮吸附百分比为98.3%吸附百分比＝(每克树脂吸附量×树脂量)/上样总黄酮量，表明样品液中总黄酮已吸附完全，而每克树脂吸附量为23.6mg，未达饱和。装柱量为20g的色谱柱总黄酮吸附百分比为62.1%，表明未吸附完全；而每克树脂吸附量为74.5mg，吸附量已达饱和。其吸附量74.5mg.g-1(干树脂)即为AB-8型大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮的饱和动态吸附-洗脱量，上柱总黄酮量与树脂比为113.4。
3.5 上柱液浓度对AB-8型大孔吸附树脂吸附鱼腥草总黄酮的影响，结果见表5。
表5表明，上柱液中总黄酮含量相同，而浓度、体积不同(2BV、3BV、4BV)时，对鱼腥草总黄酮吸附量有影响。4BV上柱液体积最大、浓度最低，过柱后残液中总黄酮含量最多，吸附量最低，损失量(未被吸附量)占总黄酮总量的17.96%；而2BV体积上柱液浓度最大，其过柱时间最短，损失量最小为6.59%。由此可见，提高上柱液浓度有利于吸附和节省时间。
3.6 冲洗杂质用水量对AB-8型大孔树脂吸附鱼腥草总黄酮回收率影响，结果见表6。
表6表明，吸附后用水冲洗对已吸附的总黄酮会有一定量的损失，水洗次数越多，损失量越大，水洗3次损失吸附量的17.93%，但水洗可除去杂质，提高总黄酮纯度。
3.7 洗脱剂洗脱次数对AB-8型树脂吸附鱼腥草总黄酮回收率影响，结果见表7。
从表7可看出，总黄酮洗脱量主要集中在第1、2两次，占总黄酮洗脱量的93.85%。洗脱剂用量为2倍树脂体积。, http://www.100md.com(罗显华 郁建生)