罗晓莉 周耀芳

    广州中医药大学青蒿研究中心生物技术室，广东 广州 510405

    青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体PBI121-SS的构建

    罗晓莉 周耀芳

    广州中医药大学青蒿研究中心生物技术室，广东 广州 510405

    目的：利用基因工程对野生青蒿进行人工操纵来提高其青蒿素生产能力。方法：从已有载体pROKII-SS通过PCR获得鲨烯合酶基因(SS)，然后连接pMD-18载体，测序后，酶切，连接表达载体PBI121-SS，通过菌液PCR，抽取质粒，酶切检测。结果：通过上述方法植物表达载体PBI121-SS构建成功，并转化农杆菌LBA4404。

    青蒿素；反义基因；载体构建

    青蒿素(artemisinin)是我国科学家从传统抗疟中药——菊科蒿属的青蒿(Artemisia annua L.)中分离提纯出的含有过氧桥结构的类异戊二烯化合物。其合成的衍生物还有双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，它们在疟疾治疗上具有高效、速效和低毒等特点，已成为疟疾流行地区的“灵丹妙药”。可是除青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。青蒿虽然系世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大，且含量仅占叶片干重的0.5%左右，最多也不超过1%。本研究拟在克隆青蒿鲨烯合酶基因(SS)的基础上，利用根癌农杆菌Ti质粒衍生的双元载体系统构建反义SS基因表达载体，然后利用实验方法转化青蒿外植体和再生转基因植株，通过阻遏青蒿内源SS基因表达以降低类固醇的合成并将碳流引向青蒿素合成的可能性，最终提高青蒿素含量。

    1 材料

    1.1 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α由本实验室保存；pMD-18 T载体购自TaKaRa公司；pROKII-SS载体本实验保存；PBI121载体由本校热研所提供；根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)菌株载体购自TaKaRa公司。

    1.2 试剂 质粒DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自Life Technologies公司；聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增试剂盒、Taq酶、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Takara公司 ......