广藿香油及其主要成分对斑马鱼胚胎发育毒性的比较研究(1)
【摘要】目的：观察和比较广藿香油及其主要成分广藿香醇、广藿香酮对斑马鱼胚胎发育的毒性。方法：分别将发育10h的胚胎置于梯度浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮中培养，于24h、48h、72h、96h观察和统计各组斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率、胚胎形态、摆尾次数和心率。结果：随作用时间延长，三种药物毒性表现越明显；24h时广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼的LD50分别为503、129mg/L，广藿香油组无明显致死现象； 96h时广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎的LC50分别为2122、12863、1176mg/L。对比12mg/L浓度下三种药物的毒性，广藿香醇和广藿香酮在24h时主要表现为生长缓慢、止于体节期，96h时表现为导致幼鱼脊柱侧弯，心脏肿大，卵黄囊肿大、摆尾次数和心率明显下降等现象；广藿香油在各时间点主要表现为延缓黑色素的生成和轻微的心脏毒性；对比结果表明，广藿香酮毒性最明显。结论：广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼均有胚胎发育毒性，毒性大小：广藿香酮>广藿香醇>广藿香油。
【关键词】广藿香油；广藿香醇；广藿香酮；斑马鱼；胚胎发育毒性
【中图分类号】R927【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)21-0014-03
斑马鱼为鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带鱼。斑马鱼为体外受精，胚胎发育透明，便于观察，且与人类基因的相似度达到87%，对药物反应与人临床反应相似，是毒理学评价的重要模型。同时，斑马鱼个体小，能大规模繁殖，便于大量获取实验所需样品，有着传统整体动物和细胞不可比拟的优势，成为当前生命科学研究中常用的三种主要模式脊椎动物之一。
广藿香是唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth的干燥地上部分，其味辛，性微温，归脾、肺、胃经，为湿浊中阻呕吐之要药，可单用或配伍用于治疗妊娠呕吐属气滞湿阻。《本草图经》记载广藿香为“治脾胃吐逆为最要之药”。挥发油是广藿香的主要有效物质，而广藿香醇和广藿香酮为挥发油中的主要成分[3，4]。现代研究表明，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮有抗菌作用；广藿香醇有抗肿瘤和神经保护的作用，具有开发为抗菌药物和抗肿瘤药物的潜力，但安全性尚不清楚。研究采用模式动物斑马鱼，旨在探讨和比较广藿香油及其主要成分的胚胎毒性。
1材料
11实验药物广藿香油、广藿香醇、广藿香酮(批号：20150130，成都中医药大学药物研究所)，均以二甲基亚砜(DMSO)配成200 g/L的浓缩液。实验室用斑马鱼胚胎繁殖培养液 (137mmol/L NaCl，054 mmol/L KCl，0025 mmol/L Na2HPO4，0044 mmol/L KH2PO4，13 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MgSO4，042 mmol/L NaHCO3)稀释。
12实验动物健康AB品系野生型斑马鱼，培育于成都中医药大学斑马鱼实验室。
13仪器Leica 型体视荧光显微镜(M165Flc)；斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；MGC-100光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
14试剂氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾等试剂均为分析纯；二甲基亚砜(DMSO，批号：SZBE0170V，SIGMA公司)。
2方法
21胚胎收集依照斑马鱼及相关实验技术中所述方式，将斑马鱼养殖在控制光周期为14∶10(即光照14h，黑暗10h)，水温控制在285±05℃的条件下，每日饲喂新出壳幼虾两次。繁殖时，将斑马鱼按雌：雄=1∶1的比例放入繁育盒内，并用隔板分离。次日，光照期开始时，抽去隔板完成交配，3h后吸去粪便等污物，用新鲜培养液冲洗两次，置于恒温培养箱中培养，温度275～285℃。
22给药将受试药物的浓缩液用鱼卵培养液按二倍梯度稀释为6个浓度，即100、50、25、12、6、3、15mg/L。带斑马鱼发育至10h时，按15个/孔置于24孔板，将胚胎分为溶剂对照组、广藿香油、广藿香醇和广藿香酮的各剂量组，分别加入相应的药液，其中溶剂对照组加入DMSO，并设置空白对照。所有胚胎均置于恒温培养箱中孵育。
23观察指标
231对斑马鱼胚胎发育的死亡率、存活率及LD50死亡率是药物对斑马鱼胚胎发育毒性最直观的指标，从10h起连续培养在对应浓度的对照组和药液中，分别在24h、48h、72h、96h，于显微镜下观察记录各组斑马鱼胚胎的死亡和存活情况，并计算不同时间点的LD50。死亡率=死亡数/胚胎总数×100%；成活率=成活数/胚胎总数×100%。
232对斑马鱼胚胎发育的畸形率以上三种药物斑马鱼胚胎发育至48h时开始出现畸形，因斑马鱼胚胎发育至96h基本完成，统计48～96h期间斑马鱼胚胎发育的畸形率。畸形率=胚胎畸形数/胚胎总数×100%。
233对斑马鱼胚胎发育的摆尾次数斑马鱼最初的运动特征为24h的自主抽动，即摆尾次数，是由脊柱的运动神经支配肌肉系统发生的。斑马鱼胚胎发育至24h时尾部开始抽动。记录24h时每个浓度下1min内斑马鱼胚胎鱼尾的摆尾数。
234对斑马鱼胚胎发育的心率48h斑马鱼心脏发育完全，对于心跳次数的统计可观测药物在胚胎心脏发育时期的作用的强弱。斑马鱼胚胎发育至48h，其心脏发育基本完成。记录30s内斑马鱼胚胎心脏跳动次数。
24数据分析采用SPSS170统计分析软件包建立数据库，采用Bliss法计算LD50；计量数据采用单因素方差分析，P<005表示差异具有统计学意义。
3结果
31对斑马鱼胚胎发育的LD50于10h给予不同浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，在不同的暴露时间点以胚胎死亡为终点观察指标，结果显示，随着给药浓度的增加和暴露时间的延长，3种药物对斑马鱼的致死性越强。24h时，广藿香酮和广藿香醇对斑马鱼胚胎的LD50分别为503、129mg/L，广藿香油在实验浓度内未表现出明显的致死性。96h时，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎的LD50分别为212、129、118mg/L，见下表1。结果表明，三个药物均对斑马鱼均有胚胎发育毒性，其毒性由大到小分别为广藿香酮>广藿香醇>广藿香油，且毒性与药物浓度和暴露时间密切相关。, 百拇医药(杨雨婷何育霖)
【关键词】广藿香油；广藿香醇；广藿香酮；斑马鱼；胚胎发育毒性
【中图分类号】R927【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)21-0014-03
斑马鱼为鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带鱼。斑马鱼为体外受精，胚胎发育透明，便于观察，且与人类基因的相似度达到87%，对药物反应与人临床反应相似，是毒理学评价的重要模型。同时，斑马鱼个体小，能大规模繁殖，便于大量获取实验所需样品，有着传统整体动物和细胞不可比拟的优势，成为当前生命科学研究中常用的三种主要模式脊椎动物之一。
广藿香是唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth的干燥地上部分，其味辛，性微温，归脾、肺、胃经，为湿浊中阻呕吐之要药，可单用或配伍用于治疗妊娠呕吐属气滞湿阻。《本草图经》记载广藿香为“治脾胃吐逆为最要之药”。挥发油是广藿香的主要有效物质，而广藿香醇和广藿香酮为挥发油中的主要成分[3，4]。现代研究表明，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮有抗菌作用；广藿香醇有抗肿瘤和神经保护的作用，具有开发为抗菌药物和抗肿瘤药物的潜力，但安全性尚不清楚。研究采用模式动物斑马鱼，旨在探讨和比较广藿香油及其主要成分的胚胎毒性。
1材料
11实验药物广藿香油、广藿香醇、广藿香酮(批号：20150130，成都中医药大学药物研究所)，均以二甲基亚砜(DMSO)配成200 g/L的浓缩液。实验室用斑马鱼胚胎繁殖培养液 (137mmol/L NaCl，054 mmol/L KCl，0025 mmol/L Na2HPO4，0044 mmol/L KH2PO4，13 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MgSO4，042 mmol/L NaHCO3)稀释。
12实验动物健康AB品系野生型斑马鱼，培育于成都中医药大学斑马鱼实验室。
13仪器Leica 型体视荧光显微镜(M165Flc)；斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；MGC-100光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
14试剂氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾等试剂均为分析纯；二甲基亚砜(DMSO，批号：SZBE0170V，SIGMA公司)。
2方法
21胚胎收集依照斑马鱼及相关实验技术中所述方式，将斑马鱼养殖在控制光周期为14∶10(即光照14h，黑暗10h)，水温控制在285±05℃的条件下，每日饲喂新出壳幼虾两次。繁殖时，将斑马鱼按雌：雄=1∶1的比例放入繁育盒内，并用隔板分离。次日，光照期开始时，抽去隔板完成交配，3h后吸去粪便等污物，用新鲜培养液冲洗两次，置于恒温培养箱中培养，温度275～285℃。
22给药将受试药物的浓缩液用鱼卵培养液按二倍梯度稀释为6个浓度，即100、50、25、12、6、3、15mg/L。带斑马鱼发育至10h时，按15个/孔置于24孔板，将胚胎分为溶剂对照组、广藿香油、广藿香醇和广藿香酮的各剂量组，分别加入相应的药液，其中溶剂对照组加入DMSO，并设置空白对照。所有胚胎均置于恒温培养箱中孵育。
23观察指标
231对斑马鱼胚胎发育的死亡率、存活率及LD50死亡率是药物对斑马鱼胚胎发育毒性最直观的指标，从10h起连续培养在对应浓度的对照组和药液中，分别在24h、48h、72h、96h，于显微镜下观察记录各组斑马鱼胚胎的死亡和存活情况，并计算不同时间点的LD50。死亡率=死亡数/胚胎总数×100%；成活率=成活数/胚胎总数×100%。
232对斑马鱼胚胎发育的畸形率以上三种药物斑马鱼胚胎发育至48h时开始出现畸形，因斑马鱼胚胎发育至96h基本完成，统计48～96h期间斑马鱼胚胎发育的畸形率。畸形率=胚胎畸形数/胚胎总数×100%。
233对斑马鱼胚胎发育的摆尾次数斑马鱼最初的运动特征为24h的自主抽动，即摆尾次数，是由脊柱的运动神经支配肌肉系统发生的。斑马鱼胚胎发育至24h时尾部开始抽动。记录24h时每个浓度下1min内斑马鱼胚胎鱼尾的摆尾数。
234对斑马鱼胚胎发育的心率48h斑马鱼心脏发育完全，对于心跳次数的统计可观测药物在胚胎心脏发育时期的作用的强弱。斑马鱼胚胎发育至48h，其心脏发育基本完成。记录30s内斑马鱼胚胎心脏跳动次数。
24数据分析采用SPSS170统计分析软件包建立数据库，采用Bliss法计算LD50；计量数据采用单因素方差分析，P<005表示差异具有统计学意义。
3结果
31对斑马鱼胚胎发育的LD50于10h给予不同浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，在不同的暴露时间点以胚胎死亡为终点观察指标，结果显示，随着给药浓度的增加和暴露时间的延长，3种药物对斑马鱼的致死性越强。24h时，广藿香酮和广藿香醇对斑马鱼胚胎的LD50分别为503、129mg/L，广藿香油在实验浓度内未表现出明显的致死性。96h时，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎的LD50分别为212、129、118mg/L，见下表1。结果表明，三个药物均对斑马鱼均有胚胎发育毒性，其毒性由大到小分别为广藿香酮>广藿香醇>广藿香油，且毒性与药物浓度和暴露时间密切相关。, 百拇医药(杨雨婷何育霖)