南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300

    正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究

    涂清波陆冬莺林颖苏鹏亮马宇凡王赛男徐丹*

    南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300

    目的优选蚓激酶提取工艺参数。方法以赤子爱胜蚓为原料，通过正交试验法，以酶的活性为指标，考察缓冲液pH值、第一次盐析和第二次盐析的饱和度对提取效果的影响，得到蚓激酶粗品经凝胶层析、离子交换层析、透析、超滤等工序制备高活性蚓激酶。结果在缓冲液pH7.5，第一次盐析硫酸胺饱和度为40%，二次饱和度为80%时，蚓激酶比活达3327 u/mg。结论该提取工艺稳定性好，酶活性高。

    蚓激酶；提取；工艺优化

    蚓激酶又称蚯蚓纤溶酶，1983年由Mihara等[1]首次从蚯蚓中提取分离出来，命名为Earthworm fibrinolytic enzyme(EFE)。2015版药典标准定义为：系人工养殖的赤子爱胜蚓中提取制备的一组蛋白水解酶。目前报道的EFE有几十种，经氨基酸序列测序表明[2-3]，这些酶均具有相似的氨基酸组成，较高的甘氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸含量和较低的赖氨酸含量，与人纤溶酶差异明显。一般认为EFE是丝氨酸蛋白酶，分子量20000～40000、等电点3～5，兼有激酶和纤溶酶两种作用。可直接水解纤维蛋白和凝血因子Ⅰ，选择性激活血块纤溶酶原，抑制血栓素等，具有降低血液黏稠度、减少血小板聚集、改善微循环等作用，临床上用于治疗多种血栓性疾病[4-5]。蚓激酶为第三代溶栓药，具有溶栓作用强、不良反应小、患者易耐受、半衰期长等特点[6-9]。

    1 仪器与材料

    1.1 仪器 2-16型冷冻离心机(Sigma公司)；分部收集器(上海沪西分析仪器厂)；DS-1高速组织捣碎机(上海右一仪器有限公司)；冷冻干燥机(上海豫明仪器有限公司)；电子分析天平和pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)。

    1.2 材料 赤子爱胜蚓(汇丰蚯蚓养殖基地)；蚓激酶、凝血酶和牛血纤维蛋白原(批号分别为140650-200502、140625-201411、140607-201539，中国药品生物制品鉴定所)；其他试剂为国产分析纯 ......