何 昕，张博爱，贾延劼，王继先

    盐酸法舒地尔 (fasudil hydrochloride，FSD)是一种新型、多靶点的Rho激酶抑制剂和细胞内Ca2+拮抗剂，对急性缺血性脑损害具有显著的神经保护和治疗作用[1-2]，其在脑血管疾病中的临床作用逐渐受到重视。关于FSD对脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)引起的大鼠皮质神经元损伤是否有抑制作用以及这种作用是否与抑制磷酸化 c-Jun氨基端激酶1(JNK1)有关鲜有报道。本实验通过LPS诱导神经元建立损伤模型，用FSD干预后检测神经元凋亡率及JNK1在细胞内表达变化，探讨FSD对兴奋毒性致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及其可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 动物及主要试剂 由郑州大学医学院实验动物中心提供SPF级健康新生SD大鼠。FSD(天津红日药业股份有限公司);LPS、Neurobasal培养基、胰蛋白酶、二抗 (羊抗兔)、JNK1和磷酸化的JNK1(美国Sigma公司);胎牛血清、B27试剂 (美国Gibco公司);吖啶橙 (acridine orange，AO)/嗅乙啶 (ethidium bromide，EB)荧光试剂盒、乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase，LDH)定量检测试剂盒 (武汉博士德生物制品公司);0.3%Triton X-100(北京中山试剂公司);其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

    1.2 新生大鼠皮质神经元原代培养 新生 (出生24 h以内)SD大鼠经乙醇消毒后断头，取出大脑皮质脑组织，用冰冷D-Hank's液洗3次，仔细轻柔地剥离血管及脑膜，用眼科剪剪成约1 mm3的组织块，放于0.25%的胰蛋白酶中消化约10 min，期间每隔5 min晃动1次。加入胎牛血清终止消化，移入无菌离心管并用吸管吹打均匀;置离心机中以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入培养液 (Neurobal培养基500 ml添加B27试剂10 ml;青霉素G 5万U;链霉素5万U;L-谷氨酰胺1 mmol，pH值7.20)吹打至细胞分散均匀，用200目筛网过滤到培养皿中，使细胞密度为 (1～3) ×106个/cm3，然后接种到用0.01%多聚左旋赖氨酸包被的24孔培养板中。置于含5%CO2培养箱中，37℃培养，24 h后第1次换液，以后每3 d换液1次，培养7 d后备用。

    1.3 实验分组 细胞随机分为3组:(1)对照组;(2)LPS组:培养基中加入LPS使其终浓度为10 mg/L;③FSD+LPS组:培养基中加入FSD使其终浓度分别为50μmol/L、100 μmol/L和200μmol/L ......