熊正文,李永申,李 伟,李宏伟,黄 勇,张华东,寻凤华

    上皮 -间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是多细胞生物胚胎发生的基础过程,在胚胎发育早期较为多见,也存在于多种慢性疾病以及肿瘤的发生、发展过程中,它以上皮细胞极性丧失及其间质特性的获得为主要特征[1]。EMT在肿瘤的发生、浸润和转移中扮演着重要角色[2],研究表明转录因子 Snail可促使 EMT的发生[3],其在乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌等多种肿瘤中呈高表达[4]。本研究采用原位分子杂交技术分别检测 Snail mRNA在乳腺浸润性导管癌、乳腺导管内癌及乳腺单纯性增生组织中的表达,旨在探讨其与肿瘤的发生、发展和浸润转移的关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料 收集经临床病理医生诊断为乳腺单纯增生、乳腺导管内癌的组织标本各 30例,乳腺浸润性导管癌组织标本 70例。70例乳腺浸润性导管癌患者中肿瘤直径 <2 cm者 9例,≥2 cm者 61例;局部腋窝淋巴结转移阴性者 21例,阳性者49例。根据 WHO的组织学分级标准:Ⅰ级 15例,Ⅱ级 35例,Ⅲ级 20例。标本均来自中国人民解放军 251医院病理科2008—2009年存档的资料,患者年龄 22～75岁,平均 47岁,术前均未接受化疗、激素治疗及放疗。组织标本经 10%甲醛溶液常规固定,石蜡包埋,连续切片 4μm,裱于经 APES处理的载玻片上,65℃烤箱烤片过夜,防止脱片。

    1.2 试剂及其来源 Snail原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司 (MK2640-h),探针为针对人 Snail靶基因的 mRNA序列 (5'-AGAGTTTACCTTCCAGCAGCCCTACGACCAGGCCC-3';5'-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTGCAA-CAAGGAATA-3';5'-TACCAGTGCCAGGCGTGTGCTCGGACCTTCTCCCG-3'),显示系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记链霉卵白素 (SABC-POD),DAB显色。

    1.3 原位杂交 石蜡切片复温,脱蜡至水。3%H2O2室温下作用 10 min,蒸馏水洗 3次,3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶室温下消化 30 min。1%的多聚甲醛室温下固定 10 min,蒸馏水洗3次,每张切片滴加 20μl预杂交液,置湿盒中放入 40℃恒温箱 4 h。滴加杂交液 20μl/片,置 38～42℃恒温箱中过夜。37℃预温的 2×SSC冲洗 5 min×3次,37℃预温的 0.5×SSC冲洗 5 min×3次,37℃预温的 0.2×SSC冲洗 5 min×3次 ......