汤 喻，张晓娟，王守俊

    糖尿病治疗药物人胰岛素通过激活胰岛素受体 (insulin receptor，IR)、胰岛素样生长因子 -1受体 (insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)及下游信号通路，发挥促有丝分裂作用，引发了人们对于胰岛素及其类似物与肿瘤风险的关注[1]。体外细胞实验证实人胰岛素、长效胰岛素类似物甘精胰岛素 (insulin glargine，Glargine)能够促进乳腺癌细胞增殖[2]。地特胰岛素 (insulin detemir，Detemir)是近年来临床上常用的一种长效胰岛素类似物，去除了人胰岛素B30位的氨基酸，并在B29位的赖氨酸上增加了一个肉豆蔻酸侧链。这种分子结构的变化，使它对IR、IGF-1R的亲和力较人胰岛素明显下降[3]，因此促有丝分裂能力可能弱于其他胰岛素。不同类型的乳腺癌细胞中IR、IGF-1R表达高低不同，胰岛素及类似物对其生长的影响也不同。本实验通过研究地特胰岛素对雌激素受体 (estrogen receptor，ER) (+)MCF-7细胞和ER(-)MDA-MB-231细胞体外作用，比较地特胰岛素对不同类型乳腺癌细胞生长的作用及可能涉及的信号通路。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞株购于中科院上海生科院细胞库。MTT试剂盒、碘化丙啶 (PI)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt(ser473)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)、p-Erk1/2抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司，辣根过氧化物酶 (HRP)标记山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基 (含双抗)，37℃、5%二氧化碳 (CO2)环境中生长。取进入对数生长期细胞进行实验。

    1.2.2 MTT法检测细胞增殖 细胞以3×103个/孔接种于96孔板，贴壁24 h，行以下处理:(1)1、10、100、1 000 U/L地特胰岛素作用48 h; (2)1 U/L地特胰岛素作用24、48、72、96 h，以上均设正常对照组。每孔加入10μl MTT液，培养4 h。吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜 (DMSO)100 μl，震荡摇匀10 min后，酶标仪在490 nm处测量各孔吸光度值。

    1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 细胞以8×104个/孔接种于6孔板 ......