孟繁杰，曹 斌，冯增利，王海刚，马顺茂，赵文增，尹东剑

    无论是在自然发生的肝癌中还是在人工鼠肝癌模型中，都频繁检测到了H-ras的突变[1-2]。文献报道，在肝癌中H-ras的突变率在29.3%～57.1%[3-4]。抑制突变的H-ras的表达，可有效抑制肝癌细胞的生长[5]。因此，对肝癌的基因治疗可以通过抑制突变的H-ras而实现。本研究采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，通过检测BEL7402肝癌细胞株H-ras的突变类型，进而设计出特异性的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体，从而达到只抑制第12位密码子GGC突变形式为GTT的H-ras，而不影响野生型H-ras的目的。

    1 材料与方法

    1.1材料肝癌细胞株BEL7402(H-ras第12位密码子GGC突变为GTT)和SMMC7721(H-ras第12位密码子为野生型的GGC)，均购自美国American Type Culture Collection(ATCC)。pSilencerTM4.1-CMV hygro试剂盒购自美国Ambion公司。大肠埃希菌(E.coli) DH5α为本室保存。质粒中量抽提纯化的试剂盒购自Promrga公司。RPM 1640培养基购自Sigama公司。Trizol购自Invitrogen公司。cDNA第一链反应试剂盒购自Fermentas公司。PCR引物及插入序列由上海生工生物工程公司合成。H-ras小鼠单克隆抗体购自Lab Vision公司。辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。考马斯亮蓝蛋白分析试剂盒购自南京建成生物公司。

    1.2方法

    1.2.1细胞株H-ras的mRNA表达检测将BEL7402和SMMC7721细胞用Trizol消化，按Trizol说明书提取总RNA备用。紫外分光光度计定量总RNA，调整浓度为1 μg/μl。按cDNA第一链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。H-ras的引物序列：上游5′-GCGCCTGTGAACGGTGG-3′，下游5′-TGGGCACGTCATCCGAGTCC-3′，扩增长度397 bp。PCR 参数：94 ℃ 10 min变性，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸5 min。PCR产物于2%琼脂糖电泳，电压100 V，45 min。

    1.2.2编码shRNA的插入片段的合成根据GenBank数据库提供的已知H-ras基因[NM_001130442.1]的序列 ......