郝 苗，齐凤杰，马 玲

    14-3-3已经被发现是广泛分布于多种生物体中的一种高度保守的可溶性酸性蛋白家族,在1967年时由Moore 和Perez对牛脑蛋白系统分类时首次发现,共分为7个亚型,有不同的基因编码[1]。随着克隆技术的发展及14-3-3 cDNA 文库的建立,人们对该蛋白的生物学特性及其功能有了较全面且深入的认识。14-3-3 以同源或异源二聚体的形式存在,与多种细胞蛋白等结合并相互作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要成员，并且是14-3-3家族中惟一能够被DNA损伤所诱导的成员。大量研究表明，14-3-3σ是细胞周期的负调控因子，它的活化可以使细胞周期停滞于G2/M期，从而抑制细胞的生长。研究发现，14-3-3σ的表达下调能够使人上皮细胞无限制地增殖[2]，这就说明了14-3-3σ表达的降低有助于肿瘤的形成，促进细胞的无限增殖。14-3-3σ在正常的乳腺上皮细胞呈高表达，而在许多种癌中表达下调，包括乳腺癌、宫颈癌、胃癌。

    但是14-3-3σ如何调节肿瘤的发展，14-3-3σ的表达是否与肿瘤的恶性程度相关，目前还不是特别清楚。14-3-3σ在人乳腺癌细胞中的表达下降被认为是乳腺癌发生的一个重要原因之一，所以其可以作为人类乳腺上皮癌变的一个特异性标记[3]。本研究旨在通过构建携带增强绿色荧光蛋白基因的14-3-3σ真核表达载体及由脂质体介导转染至乳腺癌MCF-7细胞,观察其蛋白转位,为下一步研究14-3-3σ稳定表达对乳腺癌发展的影响提供实验工具。

    1 材料与方法

    1.1 工具酶和试剂 乳腺癌MCF-7细胞,胎牛血清(杭州四季青),1640培养基(GIBCO公司),DNAmarker、内切酶BamH I、HindⅢ、聚合酶链反应(PCR)产物回收试剂盒、质粒大量提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒(TaKaRa公司),脂质体2000和G418(GIBICO公司),小鼠抗人14-3-3σ单克隆抗体、β-actin一抗(Santa Crut公司),磷酸盐缓冲液(PBS)、TBE缓冲液、LB培养基(实验室自配)，携带增强绿色荧光重组真核表达质粒pEGFP-GV418(上海吉凯基因化学技术有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 引物设计及总RNA的提取 根据GenBank 中已经发表的mRNA 序列(登录号：NM011740)设计带酶切位点的人14-3-3 基因的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物 ......