刘淑歌，赖德源

    微量清蛋白尿是糖尿病肾病 (DN)最早的临床表现，足细胞发生上皮-间叶细胞转分化 (EMT)是导致蛋白尿的一个重要原因[1]，在 DN的发生发展过程起着重要作用[2-4]。Wnt/β-catenin信号通路可能通过其目的基因snail诱导阿霉素肾病小鼠足细胞发生EMT及蛋白尿[5]，在肾脏发育、肾脏肿瘤[6]中起着重要作用，但Wnt/β-catenin信号通路是否参与DN足细胞损伤目前尚不清楚。本研究通过观察活化的βcatenin分子在高糖诱导足细胞EMT过程中的表达，探讨Wnt/β-catenin信号通路在高糖诱导足细胞EMT中的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，雌性，体质量150～180 g，购自中山大学实验动物中心，实验动物合格证号:4407208043，实验动物使用许可证:SCXK(粤)2011-0029。

    1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基 (Gibco，USA)，RPMI 1640无糖培养基 (Gibco，USA)，胰岛素 -转铁蛋白 -硒(ITS) (美国 Gibco)，Anti-Nephrin antibody(Abcom，USA)，Anti-alpha smooth muscle Actin antibody(Abcom，USA)，beta-tubulin(Epitmic)，Non-phospho(Active)βcatenin(Ser33/37/Thr41) (D13A1)Rabbit mAb(CST，USA)，Rabbit polyclonal to Wnt-1(Santa cruz，USA)。其余材料均购自中国威佳公司。

    1.3 方法

    1.3.1 肾小球足细胞培养与处理 大鼠脱臼处死后于超净台内无菌取出双肾，去除肾包膜，分离肾皮质，依次通过80目、150目、200目不锈钢细胞筛网，收集200目不锈钢细胞筛网上组织即为肾小球。75 cm2培养瓶预先铺Ⅰ型胶原，将收集的肾小球种于培养瓶中，每瓶加完全培养基10 ml，5 d首次换液，7 d传代，第14天完全分化可用。观察细胞形态并采用间接免疫荧光法检测nephrin和Wt-1的表达。为观察高糖对足细胞EMT的浓度效应，设置正常糖组 (D-葡萄糖5 mmol/L)、高糖组 (D-葡萄糖15 mmol/L、30 mmol/L)，作用48 h;高渗对照组 (甘露醇25 mmol/L+D-葡萄糖5 mmol/L)。为观察高糖对足细胞EMT的时间效应，将足细胞置于30 mmol/L高糖环境下作用0、12、24、48 h ......