侯国芳，刘 艳，张霄蓓，刘晶晶，张 晟，张 瑾

    1997年John Dick等人首次提出急性髓性白血病的发生、发展是由于一些具有自我更新、多系分化以及有成瘤能力的细胞所造成的，并将其命名为干细胞(CSCs)[1]。随后，2003年Al-Hajj等[2]采用CD44+CD24-/lowlin-表面标记分子分离出乳腺癌干细胞。鉴于肿瘤干细胞特殊的地位，其治疗成为当前研究的热点。随着医学的不断发展，癌症的治疗手段呈现多样化和规范化的趋势。在手术、化疗、放疗为主要治疗手段的大背景下，光动力疗法(PDT)近年逐渐进入人们的视野，其突出优点体现在无创性消灭局部肿瘤病灶，不良反应小，可重复性高，但其对肿瘤干细胞是否具有抑制作用，尚未可知。基于此目的，本研究采用PDT作用于MCF-7乳腺癌干细胞，通过检测生长浓度抑制曲线和分析细胞凋亡图形，探索PDT对肿瘤干细胞的作用。

    1 对象与方法

    1.1研究对象人MCF-7乳腺癌细胞系为天津市肿瘤医院公共实验室所保存。

    1.2试剂光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)购于上海先辉医药科技有限公司。RPMI1640、胎牛血清(FCS)、Hank′s液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、胰酶、B27、DMEM购于GIBCO公司；分选荧光抗体购于SANTA CRUZ生物科技公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自KeyGEN公司；胰岛素购于sigma公司；表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购于Reprotech公司。其他试剂均由天津市肿瘤医院公共实验室提供。

    1.3实验仪器37 ℃自动CO2恒温培养箱；无菌超净台；He-Ne激光器；酶联免疫检测仪、流式细胞仪等仪器由天津市肿瘤医院公共实验室提供。

    1.4实验方法

    1.4.1细胞培养及流式方法分选MCF-7乳腺癌干细胞将MCF-7细胞置于25 cm2培养瓶中进行培养，培养基为含10%FCS的RPMI1640。1～2 d换液，细胞长至80%左右进行传代，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度孵化箱进行培养。取对数期生长MCF-7细胞，0.25%胰酶消化。终止消化后，1 000 r/m，5 min离心，离心半径为15 cm,Hank′s液冲洗2遍。用Hank′s液重悬后吹成单细胞悬液，分装于5个流式管，采用CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC抗体选取表面标记为CD44+CD24-/lowESA+细胞。分选出的肿瘤干细胞采用含有EGF 20 μg/L、bFGF 10 μg/L、胰岛素5 mg/L和B27(1∶50)的DMEM-F12培养液培养 ......