郑亚莉，陆晓华，曹 丽，王 慧，李 博，鄂 静，保 莉，罗红艳，兰晓梅

    糖尿病的病理生理机制主要是β细胞数量的减少和功能障碍导致胰岛素分泌减少。β细胞的减少在糖尿病发生之前即存在，并贯穿于整个糖尿病发病的始终[1-3]。研究发现,慢性葡萄糖毒性抑制胰岛素分泌、胰岛素基因表达缺陷及氧化应激可导致β细胞损害和凋亡[4-6]。近期的研究发现细胞周期素依赖的蛋白激酶5(CDK5) 及其激活蛋白p35广泛存在于胰腺β细胞，可能参与胰岛素分泌调节[7]。CDK5的主要激活剂p35主要存在于中枢神经组织，与CDK5结合使其激活，参与神经递质的分泌并对维持神经元的正常功能发挥重要的作用[8]。由于胰岛β细胞与神经元有着共同的外分泌特征[9]，近年来发现高糖环境下、p35表达增高，参与了哺乳动物血糖的调节[10]，但其机制如何，相关研究报道较少。本研究通过采用不同浓度葡萄糖刺激胰岛β细胞，观察p35和其裂解产物p25的表达水平、CDK5活性、胰岛素分泌变化以及胰岛β细胞的凋亡情况，研究p35在胰岛素调节过程中可能的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 CDK5单克隆和多克隆抗体(C-8)、p35多克隆(C-19)抗体购自Santa Cruz公司；一步法cDNA合成试剂盒、Lipofectamine基因转染试剂购自Invitrogen公司；DMEM培养液购自Gibco公司； DMSO购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；CDK5、p35、胰岛素分泌测定酶标免疫试剂盒购自Linco Research 公司。

    1.2 方法 采用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L组、20 mmol/L组和30 mmol/L组)刺激胰岛β细胞6 h，收取和固定细胞，行免疫印迹和免疫荧光法测定p35的表达；将p35基因克隆到腺病毒载体中，将p35病毒和空载体病毒(EV)分别转染到胰岛β细胞中(p35组和EV组)，测定p35蛋白表达、CDK5活性及胰岛素分泌水平；为进一步证实CDK5活性可以调节胰岛素分泌，采用CDK5抑制剂(p35+Ros组)进行抑制试验；为验证p25可引起胰岛β细胞的损伤，采用细胞凋亡相关抗体Cleaved caspase 3测定胰岛β细胞凋亡，具体如下。

    1.2.1 细胞培养 Min6小鼠胰岛β细胞(由NIH，Dr.Abner Notkins′lab 赠送)。胰岛β细胞在含4.5 mg/ml葡萄糖，10%胎牛血清加100 U/ml青霉素G和100 μg/ml链霉素的细胞培养皿中培养。

    1.2.2 免疫沉淀及CDK5活性测定 用细胞裂解液收取细胞 ......