李 晶，姜 北，万 鹏，李 娜，王于理，巩 平

    肺癌是严重威胁人类健康的疾病，其发病率呈逐年上升趋势，是目前病死率最高的恶性肿瘤，而患者死亡的主要原因是肿瘤的复发和远处转移[1-3]。血行播散是肺癌转移的重要途径，肿瘤细胞可以通过血液循环发生远处转移。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC) 是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞，与肿瘤血行转移密切相关，在肿瘤转移的环节中扮演重要角色[4]。本研究通过检测晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者化疗前后外周血CTC表达情况，分析其与临床特征、疗效的关系，探讨CTC预测晚期NSCLC化疗疗效的临床价值。

    1 资料与方法

    1.1 临床资料 选择2011年6月—2012年2月石河子大学医学院第一附属医院收治的晚期原发NSCLC患者30例为肺癌组，其中男17例，女13例；年龄 43～79岁,中位年龄 67岁。均经病理或活检证实为NSCLC，按2010年美国国立综合癌症网络(NCCN)NSCLC标准分为：ⅢA、ⅢB及Ⅳ期。入组前均未接受任何抗肿瘤治疗，预计生存期>3个月，依从性好。收集同期入院治疗的肺良性疾病及健康志愿者各10例为对照组，其中男11例，女9例；年龄34～68岁，中位年龄52岁。两组患者性别构成和年龄具有均衡性，均签署知情同意书。

    1.2 主要试剂 人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；小鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin,AE1/AE3)单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(fluoresce in isothiocyanate,FITC)标记羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购自美国Sigma公司；肺腺癌A549细胞株为湖南湘雅医学院李彩霞老师惠赠。

    1.3 实验步骤

    1.3.1 标本采集 严格消毒后，应用真空采血针采取肘正中静脉血，弃去穿刺后的前2 ml，采集此后的7.5 ml静脉血。所有血样加入肝素抗凝混匀，并在采集后24 h内富集肿瘤细胞。

    1.3.2 密度梯度离心法富集肿瘤细胞 取7.5 ml抗凝全血与等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，小心加至细胞分离液层面上(2∶1)；室温下2 000 r/min(离心半径16 cm)，离心20 min；吸取环状乳白色单核细胞层，加入5 ml PBS重复洗涤2次 ......