王海峰，杨 宏，胡礼炳，雷永虹，秦 扬，李 俊，毕城伟，霍 倩

    EZH2(enhancer of zeste homolog 2)-zeste基因增强子人类同源物是PcG(polycomb group)基因家族的重要成员，其与果蝇zeste基因增强子是同源基因。该基因能够使组蛋白3第27位赖氨酸(H3K27)发生三甲基化，沉默与细胞分化、抑制增殖相关的基因，从而导致肿瘤的发生、发展[1]。近年研究表明EZH2在膀胱癌组织中表达增加，并且与浸润转移有密切关系，但其具体的作用机制未明确[2]。本研究采用基因工程技术，构建靶向沉默EZH2的小干扰RNA(siRNA2)表达载体，将其导入膀胱癌细胞建立稳定表达的细胞系，观察该载体对细胞EZH2的表达抑制作用，为探讨EZH2在膀胱癌中的作用机制及其基因治疗提供实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 膀胱癌细胞株T24由我实验室保存，pEGFP-C1表达载体购自Clontech公司，RPMI1640培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液、胎牛血清、LipofectamineTM2000脂质体购自美国Invitrogen公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔购自Santa Cruz公司，DH5a感受态细胞、小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京天根生化公司，T4 DNA连接酶购自加拿大Fermentas公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1 重组质粒设计和构建 根据GenBank提供的EZH2序列，使用在线设计软件，通过比对基因序列，合成EZH2特异性siRNA2s序列5′-GGGAAAGUGUAUGAUAAUTT-3′，阴性对照组转染入：FAM序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。siRNA2正反义链经退火形成具有粘性末端的互补双链。按照小量质粒提取纯化试剂盒说明书提取质粒pEGFP-C1，经酶切、回收线性处理后与退火双链DNA经T4 DNA连接酶4 ℃过夜定向连接，并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，并进行酶切鉴定和测序分析。鉴定正确的阳性克隆命名为实验组pEGFP-C1-siEZH2 ......