马 蕾，高梅兰，薛海波，管秀好，舒春梅，张桂芹，运蓓蕾

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选择2010年4—11月在我院门诊就诊的36例AD患儿为病例组，其中男20例，女16例；年龄3～16岁，平均(9.9±3.7)岁；采用疾病的严重程度(SCORAD)评分[4]评价患儿疾病严重程度：中度26例(15分≤SCORAD评分0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会审核通过，并由患儿监护人签署知情同意书。

    1.2 方法

    1.2.1 PBMCs的分离 所有受试者于8：00～9：00采集空腹外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，聚蔗糖(Ficoll)(ρ=1.077)密度梯度离心法分离PBMCs。

    1.2.2 PBMCs中MIF、IL-17及IL-23 mRNA的表达 采用实时定量RT-PCR，Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)提取PBMCs总RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度，吸光度值(A260/A280)介于1.8～2.0，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；采用PrimeScriptTMRT反转录试剂盒(TaKaRa，宝生物工程大连有限公司)合成cDNA第一链；设计MIF、IL-17和IL-23引物序列(见表1)，经BLAST比对，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa，宝生物工程大连有限公司)于Rotor-Gene 3000 real-time PCR仪(澳大利亚Corvett Research公司)上进行定量检测；检测数据用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0软件和双标准曲线法进行分析 ......