呼圣娟，姜荣兴，师红利，沈 皓，谢华红

    多肽pd20是本课题组在前期工作中筛选出的可特异性结合于胃癌肝高转移潜能细胞的新多肽分子，实验证实多肽pd20具有胃癌肝转移的导向性[1-2]。为了探讨此多肽是否具有携带抗癌药物或抑癌基因靶向性治疗胃癌肝转移的作用，本研究前期工作已将多肽pd20与肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行了基因融合，并构建了原核表达载体，对重组融合蛋白进行了诱导表达，此次实验目的是将pd20-TNF-α融合蛋白进行纯化，并对纯化后的蛋白进行鉴定和生物学活性检测。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞系 小鼠成纤维细胞L929购自上海中科院细胞库。胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L由本实验组制备，保存于第四军医大学消化病研究所。

    1.1.2 试剂和抗体类 Ni-NTA柱购自QIAGEN公司；蛋白Marker购自上海丽珠东风生物技术有限公司；鼠抗人TNF-α单克隆抗体购自Santa Cruz公司。RPMI 1640培养基、四甲基偶氮唑盐(MTT)、PE Annexin V细胞凋亡检测试剂盒、Matrigel胶均购自BD公司。TNF-α标准品由中国药品生物制品鉴定所提供。显色试剂ABTS为Sigma 公司产品。

    1.2 方法

    1.2.1 融合蛋白的纯化和鉴定 将含融合基因pd20-TNF-α的大肠埃希菌BL21用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4 h，13 000 r/min，离心半径为6 cm，离心1 min，收集诱导表达后的菌体，按1 g菌体加7 ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，进行超声波裂菌。收集上清液用镍柱进行纯化，具体步骤如下：(1)Equilibrium buffer平衡镍柱；(2)将稀释过滤后的溶菌上清液上样；(3)Equilibrium buffer再洗5个床体积，使目标蛋白充分挂柱；(4)Elution buffer 1洗去杂蛋白，收集洗杂峰；(5)Elution buffer 2进行洗脱，并收集洗脱峰和洗脱液；(6)将收集的洗脱液用15 ml超滤离心管超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装备用；(7)各取1 ml过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液进行活性测定和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 。

    1.2.2 SDS-PAGE及Western blotting检测 将样品进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色。将样品蛋白用电转移法转到硝酸纤维膜上，用鼠抗人TNF-α单克隆抗体为一抗 ......