曾 敏，魏 欣，李 伟，符秀虹，蒙绪卿，陈积雄，王 萍

    炎症反应是缺血再灌注细胞损伤的重要环节，其中许多黏附因子和趋化因子都有参与。近年来，越来越多的研究显示趋化因子CXCL16参与了心血管疾病的炎症反应。内皮细胞处于血管最内层，对于冠状动脉的缺血缺氧、内环境的微小变化最敏感、最迅捷。因此，本研究选择人脐静脉内皮细胞作为研究对象，通过对其进行体外模拟缺血再灌注培养，并采用小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)转染的方法探讨缺血再灌注中趋化因子CXCL16的表达及可能的调节机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料和试剂 人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)(购自ATCC)，采用添加了内皮细胞生长物、5%胎牛血清和青/链霉素的内皮细胞培养基常规培养 (购自美国科学细胞研究实验室)，siRNA〔美国Santa cruz公司 (sc-29410)〕，Lipofectamine RNAiMAX、Trizol试剂 (美国Invitrogen公司)，iScriptTMcDNA合成试剂盒 (BIORAD公司)，CXCL16 ELISA试剂盒 (美国R＆D Systems公司)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 将HUVEC复苏后转移至新培养瓶，加入内皮细胞培养基中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)条件下孵箱内培养，5～7 d传代1次，采用0.25%胰蛋白酶消化细胞。

    1.2.2 实验分组 分为4组:(1)对照组:正常内皮细胞培养基培养+siRNA阴性对照转染;(2)缺血再灌注组:模拟缺血培养液培养30 min后换正常培养液再培养4 h+siRNA阴性对照转染;(3)p65 siRNA转染组:正常内皮细胞培养基培养+p65 siRNA转染;(4)缺血再灌注+p65 siRNA转染组:模拟缺血再灌注+p65 siRNA转染 (对HUVEC转染p65 siRNA 48 h后再模拟缺血再灌注培养)。

    1.3 模拟缺血再灌注培养 将HUVEC培养在包含118 mmol/L氯化钠、24 mmol/L碳酸氢钠、1.0 mmol/L磷酸钠、2.5 mmol/L氯化钙、1.2 mmol/L氯化镁、20 mmol/L乳酸钠、16 mmol/L氯化钾、10 mmol/L 2-脱氧葡萄糖 (pH调至6.2)的“缺血液”中30 min，然后换为再灌注液即正常培养基进行“再灌注”4 h而实现。

    1.4 p65 siRNA转染 预设计好并经验证的核因子κB p65特异性siRNA和不与人类任何编码基因序列一致的对照siRNA均购自Santa cruz公司 ......