王 刚

    椎间盘源性腰痛(discogenic low back pain，DLBP)为现代骨科医学的研究难点和热点，其病因复杂，发病机制尚未明确，临床上缺乏特异的治疗方法[1]。流行病学调查结果显示，随着人们现代社会生活节奏的加快和工作强度的提升，DLBP发病率呈逐年上升趋势[2-3]。电生理学研究表明，机体在正常生理状态下，神经纤维仅存在于椎间盘纤维环外层，而DLBP患者的纤维环内层乃至髓核内部均可见神经纤维分布，提示神经纤维长入可能为DLBP的重要发病机制[4-5]，为其临床治疗方向由宏观行为学向分子生物学转变提供了新的理论支撑。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)过表达和炎性因子过分泌是DLBP发病机制中的研究热点[6-7]。本研究以椎间盘炎症大鼠为动物模型，旨在探讨小干扰RNA(siRNA)对NGF的影响，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半；体质量180～240 g，平均(223.0±12.4)g；月龄2.5～3.5个月，平均(2.9±0.7)个月；购于中山大学医学院动物中心，批号：SYXK(粤)2007-0081。

    1.2 主要仪器与试剂 主要仪器：PCR仪(C1000 Thermal cycler，BIO-RAD)，荧光定量仪(IQ5，BIO-RAD)，制冰机(AF100，Scotsman)，低温超速离心机(Scanspeed 1730，Labogene)，微型振荡器(QL-901，海门市麒麟医用仪器厂)，流式细胞仪(EPICS? ALTRATM，Beckman)等。主要试剂：LipofectamineTM2000(Inbitrogen)，Trizol总RNA提取试剂盒(Inbitrogen)，NGF酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒(Chemicon)，Oligo dT Primer、Random Primer、5×PrimeScriptTMBuffer等PCR试剂均由TAKARA公司提供；其他试剂如乙醇、氯仿等为国产分析纯；IL-6、IL-1β试剂盒购于Peprotechec公司；DMEM/F12培养基和胎牛血清购于Gibco公司。

    1.3 方法

    1.3.1 细胞体外培养 细胞体外培养方法参照参考文献[8]。(1)手术分离60只大鼠椎间盘髓核及纤维环细胞：取出椎间盘组织后立即用冰磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，分离髓核组织并在DMEM/F12培养基中剪碎，离心半径15 cm ......