叶洁梅，吴 原，黄金山，李偲俊，韦 兴，刘 云

    癫痫是神经系统的常见病、多发病。目前难治性癫痫的发病机制尚未十分清楚，突触重建是其重要的病理基础之一[1]。研究表明，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Vb(N-acetylglucosaminyltransferase Vb，GnT-Vb)和肌营养不良蛋白聚糖(dystroglycan)是重要的神经元表面受体，可与细胞外基质成分如层黏连蛋白、纤维连接蛋白等结合，介导细胞之间的黏附，参与细胞外环境信息交换，维持细胞骨架，影响神经元极性，参与神经突触的形成及突触后介质的成熟等[2]。本研究拟观察难治性癫痫细胞模型(Sombati癫痫细胞模型)中GnT-Vb和dystroglycan基因的表达变化，探讨二者在癫痫形成过程中的可能作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料 (1)实验动物：新生24 h内的SD乳鼠，SPF级，雌雄不限。(2)主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、NEUROBASAL Medium培养液、B27 Supplement(GIBICO)；Trizol、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen公司)；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)。(3)主要仪器设备：荧光定量PCR仪(ABI7500 Fast)；荧光显微镜(Olympus公司)； 二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo公司)等。

    1.2 方法

    1.2.1 原代海马神经元分离培养与鉴定 取新生24 h内SD乳鼠，于75%乙醇中浸泡消毒。断头取脑，置于预冷的D-Hank′s液中。分离双侧海马，剔除脑膜后剪碎组织，用0.125%胰蛋白酶于37 ℃的恒温水浴箱消化15 min。小心吸出胰酶后，加入5 ml种植培养液终止消化。漂洗2次，巴氏滴管轻柔吹打20次，1 000 r/min离心5 min弃上清液，重悬于种植培养液中。以200目筛网过滤，调整细胞密度为1×109/L。1.5 ml/孔移入经0.1%多聚赖氨酸包被过的6孔细胞培养板，置37 ℃ 5%CO2细胞培养箱内培养12 h后，全量更换为无血清维持培养液2 ml继续培养。每天观察细胞生长情况，每3 d半量换液1次。

    种植培养液配制：90%DMEM/F12培养基，10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素。无血清维持培养液的组成：98%NEUROBASAL Medium培养液，2%B27 Supplement ......