吴丽丹,冯胜军,卓华钦，张莞灵，刘华锋

    许多研究证实尿蛋白在慢性肾脏疾病的进展中发挥了非常重要的作用。尿蛋白的主要作用是能够活化肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,rTEC)，使其分泌各种生物活性因子，在肾间质中激活成纤维细胞和趋化炎性细胞，参与肾间质纤维化。而肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展到终末期的共同途径。肾间质纤维化与细胞增殖、凋亡的动态平衡密切相关[1-2]。但是，尿蛋白的性质(清蛋白、转铁蛋白、IgG、40～100 kD血清蛋白等)和严重程度在肾小管间质病变进展中的作用仍有很大分歧。此外，不论是体外还是动物模型中，总是存在一些问题，如大多数研究仅使用一种或两种蛋白，或者使用正常血清清蛋白而非患者的血清蛋白对肾小管细胞损伤进行研究。此外，不同病理类型肾病综合征患者的尿蛋白能否直接导致rTEC凋亡及其差异性，尚无肯定报道。因此，本实验选取临床上常见的人类不同肾病综合征患者(微小病变肾病综合征、膜性肾病综合征、局灶-节段性肾病综合征)的完整尿蛋白刺激人肾小管来源的rTEC，分析其凋亡情况，旨在为尿蛋白对人肾小管-间质纤维化的机制提供重要依据，为延缓慢性肾衰竭的进展寻找治疗新途径。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料和仪器 人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cell,hrTECs)由上海第二医科大学附属瑞金医院陈楠教授惠赠。相差显微镜下可见正常的hrTECs为多角形鹅卵石样排列，胞体扁平，细胞紧密衔接，融合成单层。已经过鉴定，确认为近端hrTECs，保证了本课题以后实验的真实性和可靠性。二氧化碳(CO2)培养箱(Heraeus，Germany)，倒置显微镜(MP-50型，Leica Germany)，荧光显微镜及成像系统(Leica German)。胎牛血清(Invitrogen)，DMEM/F12培养基(Gibco,U.S.A)，Hochest 33258(Sigma,U.S.A)。

    1.2 细胞培养 从液氮罐中取出冷冻hrTECs，37～40 ℃水中快速复溶，加适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液(含0.03% L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素)，置于培养箱内培养，培养条件为37 ℃、5%CO2。0.125%胰蛋白酶(Trysin)-0.02%乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)消化传代。

    1.3 尿蛋白的提取与质量分析 选取广东医学院附属医院肾内科已经临床确诊的原发性肾病综合征患者(微小病变肾病综合征、膜性肾病综合征、局灶-节段性肾病综合征)的尿蛋白 ......