张星南，邹 文，马进安，李学真

    肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，每年发病和死亡病例均为恶性肿瘤的首位。近十几年来人表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的广泛应用给肺癌患者带来很大的希望，但这种药物在使用10～14个月就会出现耐药。目前已知T790M突变是导致耐药的主要机制。放疗是肿瘤综合治疗的手段之一，近年来不少学者进行了放疗联合分子靶向药物临床试验，显示放疗联合分子靶向药物的疗效优于单纯放疗。但分子靶向药物耐药后的非小细胞肺癌对放疗是否敏感以及放疗后对EGFR-TKIs的耐药性是否有变化，目前尚无明确答案。故本研究对上述问题进行探讨。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞株 吉非替尼敏感肺腺癌细胞株PC-9，大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导获得的T790M突变所致吉非替尼继发性耐药肺腺癌细胞株PC-9/GR，均由广州呼吸疾病研究所赠予。

    1.1.2 试剂和仪器 吉非替尼购自英国 AstreZeneca公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；兔抗人磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)抗体及鼠抗人β-actin抗体均购自Proteintech公司；Proteintech液相芯片试剂盒及Luminex阅读仪由广州益善生物有限公司提供；液相基因芯片系统由美国 Luminex公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 液相芯片法检测PTEN mRNA的表达水平 将PC-9和PC-9/GR分别置于含10%胎牛血清的完全培养基中培养，当细胞铺满瓶底达80%以上时即可进行传代。取含有PC-9和PC-9/GR的细胞培养瓶各1个，加入裂解液，56 ℃下裂解反应2 h。采用美国NanoDrop公司超微量核酸蛋白分析仪检测总mRNA纯度。将样本转移至孵育板上，加入支持探针-微球、支持延伸探针、缓冲液，55 ℃震荡孵育过夜。次日将孵育板放在磁力架上1 min，洗涤液洗3次。加入扩增延伸探针和标记探针，50 ℃震荡反应1 h，洗涤液洗2次。再加入链霉亲和素-藻红蛋白，50 ℃震荡反应30 min，洗涤液洗2次。于Luminex阅读仪上读取数据 ......