王玉珏，李云超，庄雅娟，邱 虹，陈 广，于向东

    胶质瘤是神经系统最常见的发病率最高的恶性肿瘤，且疗效不佳。本研究采用原位杂交组织化学技术(ISHH)检测正常脑组织及不同级别胶质瘤细胞中半乳糖凝集素3(galectin-3)、整合素αvβ3及基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA的表达，了解三者在脑胶质瘤中的表达规律，并初步探讨三者在分子水平方面对胶质瘤发生、进展、浸润以及血管生成中的作用，从分子水平角度为临床提供评价预后及靶向治疗的新思路。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选取2012—2013年河北联合大学附属开滦总医院病理科存档的经甲醛固定、石蜡包埋的胶质瘤标本40例，其中男26例，女14例；年龄13～68岁，平均(46±16)岁，中位年龄49岁。根据世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分级标准(2000年)，将40例标本进行分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级11例，Ⅲ级13例，Ⅳ级4例，Ⅰ、Ⅱ级为低度恶性胶质瘤组，Ⅲ、Ⅳ级为高度恶性胶质瘤组。另取同期同一医院神经外科收治的脑创伤患者内减压术中得到的5例正常脑组织标本，其中男3例，女2例；年龄35～53岁，中位年龄44岁。

    1.2 方法 标本制备：所有标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，蜡块连续切片，片厚4 μm，连续做3张切片，在55 ℃高压过的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中展片，用原位杂交专用载玻片捞片。3张切片分别用于galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA的原位杂交。galectin-3原位杂交试剂盒、整合素αvβ3原位杂交试剂盒、MMP-2原位杂交试剂盒均来自武汉博士得生物工程有限公司。3个指标的多相寡核苷酸探针序列见表1。

    检测方法如下：(1)60～65 ℃烤片2～4 h至蜡融化为止。(2)切片经二甲苯脱蜡20 min 2次，脱蜡后的切片在100%、90%、80%乙醇中分别放置20 min后，经DEPC水、磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，5 min/次。(3)3%过氧化氢(H2O2)室温浸泡5～10 min，DEPC水漂洗3次，5 min/次。(4)暴露mRNA核酸片段：每张切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化20 min，0.02 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次，DEPC水漂洗1次，约5 min。(5)后固定：0.1 mol/L PBS(pH 7.2～7.6)室温固定10 min，DEPC水漂洗3次，5 min/次。(6)预杂交：每张切片加20 μl预杂交液恒温箱42 ℃ 3 h，吸取多余液体，不洗 ......