潘 坤，张 惠，张泽明，李 峥，杨 卫，陈 晔

    低氧诱导因子1α(HIF-1α)是哺乳动物适应低氧环境的关键转录调节因子，参与了肿瘤的生长繁殖、远处转移、血管生成、细胞凋亡等[1]。HIF-1α蛋白降解的关键步骤是脯氨酰残基的羟基化，催化此过程的脯氨酰羟化酶(PHD)是整个过程的限速酶[2]。目前发现PHD有4种(PHD1、PHD2、PHD3、PHD4)，低氧情况下，PHD3发挥主要调节作用，是否可通过上调PHD3的表达，从而降低肿瘤组织中HIF-1α的表达水平及活性，并进一步抑制肿瘤的侵袭、远处转移，值得深入研究。本研究旨在通过研究非小细胞肺癌患者肿瘤组织及癌旁正常肺组织中的PHD3表达情况，及其与HIF-1α蛋白表达和非小细胞肺癌患者肿瘤淋巴结转移、临床分期等生物学特性的关系，为临床肿瘤的防治探索新的思路。

    1 材料与方法

    1.1 材料收集 收集河北大学附属医院2010年7月—2012年4月手术切除的非小细胞肺癌标本89例，取非小细胞肺癌组织、癌旁正常肺组织(距离肿瘤边缘>5 cm)标本进行实验。所有患者经病理确诊，术前未行化疗、放疗、介入及中药等抗肿瘤治疗，均有完整的病例资料且知情同意。其中男54例，女35例；确诊时年龄37～64岁，中位年龄58岁；淋巴结转移51例(淋巴结转移组)，无淋巴结转移38例(无淋巴结转移组)；肿瘤分期(TNM)：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。临床分期标准按照第7版美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)制订的TNM分期标准分类。免疫印迹法(Western blotting)检测所用的肿瘤肺组织及癌旁正常肺组织切除后立即置于-70 ℃冰冻保存。

    1.2 研究方法 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)：扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，严格按照该公司TRIZOL试剂使用说明书进行试验，提取总RNΑ，反转录后行PCR；应用琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物条带行吸光度半定量分析。反应循环参数如下：(1)HIF-1α，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共32个循环)，72 ℃延伸10 min。(2)PHD3，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共30个循环)，72 ℃延伸10 min。各检测指标及内参照物(β-actin)的引物序列分别为：(1)HIF-1α(433 bp)上游：5′-GCCCCTACTATGTCGCTTTC-3′，下游：5′-GGCCCAAACTAAACTATCTGA-3′；(2)PHD3(337 bp)上游：5′-CCTGATGACATTATCGCCTCT-3′ ......