邬黎青，詹 媛，王 莉，陈 玲，陈小青，杨 洋，高 歌，郝 华

    Nutlin-3a是近几年发现的MDM2小分子拮抗剂，能结合到MDM2上的 p53位点，阻止MDM2与p53结合，稳定内源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制细胞生长，引起细胞凋亡。在p53缺失或p53基因突变的癌细胞中，Nutlin-3a能阻止MDM2与p73α结合，增加内源性p73α的转录活性[5-6]，同时p73α能激活p53应答基因，从而抑制细胞生长，引起细胞凋亡。以前认为低量的p53引起细胞静止，而高量的p53导致细胞老化或凋亡[7]。然而2010年有研究显示，低浓度Nutlin-3a诱导p53低表达，导致细胞老化；而高浓度Nutlin-3a诱导p53高表达，导致癌细胞死亡(凋亡及有丝分裂死亡)的同时，又把部分癌细胞阻滞在静止期，这些静止期的细胞撤药后能恢复进入细胞周期，进行生长增殖[8-9],这限制了Nutlin-3a的治疗作用。肿瘤中p53基因突变很常见，而p73α基因突变却罕见[10]。对于p53基因突变的肿瘤，Nutlin-3a不能诱导其内源性p53的产生，但可通过诱导p73α来达到治疗肿瘤的目的。 Nutlin-3a抑制含野生型p53基因的结肠癌细胞生长的研究已有发表[11]，但Nutlin-3a对p53基因突变的结肠癌细胞的作用尚未见报道。 本课题研究Nutlin-3a对p53突变型结肠癌细胞株Coca-2的作用及其机制。

    1 材料与方法

    1.1 试剂、细胞株和细胞培养 Nutlin-3a〔Sigma，溶解于二甲基亚砜(DMSO)，10 mmol/L小试剂瓶分装，-20 ℃保存〕； DMEM高糖液体培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；p73α及p21抗体购自美国Abcom公司； MTT试剂盒、β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色试剂盒购自碧云天生物技术公司。人体结肠癌细胞株Caco-2(上海中科院细胞库)，用10%胎牛血清DMEM培养基培养于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃潮湿环境中。

    1.2 MTT实验 收集并调整细胞悬液浓度至合适浓度，每孔加入200 μl接种至96孔板，培养24 h后吸弃上清，实验设8组(对照组及不同浓度Nutlin-3a组)，每组设6个复孔，分别加入0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L的Nutlin-3a培养液200 μl，分别培养24、48、72 h。避光条件下进行如下操作：弃去旧培养基，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2遍，加入新培养基200 μl后 ......