邓俊亮，吴 健，杨士芳

    香烟提取物对大鼠骨骼肌细胞肌肉生长抑制素表达的影响研究

    邓俊亮，吴 健，杨士芳

    目的 探讨香烟提取物(CSE)对骨骼肌细胞肌肉生长抑制素(MSTN)表达的影响。方法 取新生3～5 d的SD大鼠的骨骼肌组织，用含150 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培养基在37 ℃、5%CO2培养箱内进行体外原代细胞培养和传代。采用免疫荧光鉴定检测骨骼肌细胞。选择恰当的CSE浓度(2.5%、5.0%、10.0%)刺激48 h，分为2.5%组、5.0%组、10.0%组和对照组(不予CSE刺激)，分别采用实时定量PCR 检测MSTN mRNA的表达水平与Western blotting 检测MSTN蛋白的表达水平。结果 骨骼肌细胞培养成活率高，体外生长、增殖良好。实时定量PCR 检测结果显示，4组MSTN mRNA 相对表达水平比较，差异有统计学意义(P1 材料与方法

    1.1 材料和仪器 新生3～5 d的SD大鼠6只，雌雄1∶1，购于中山大学实验动物中心，SPF级。15%胎牛血清(Mediatech,美国)，高糖DMEM(Gibco,美国),引物(TaKaRa,日本)，鼠抗MSTN一抗(R&D 公司,美国)，鼠抗β-actin组蛋白一抗(DSHB，美国)，驴抗羊IgG 二抗(Sigma,美国)，TRIizol(Molecular,美国)，生物发光显色剂(碧云天生物技术研究所,中国)。CO2培养箱(SANYO,日本)，倒置显微镜(Olympus,日本)，PTC 200 RT-PCR仪(MJ Research,美国)，LAS-500(富士山,日本)，聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳及转膜装置(Bio-Rad 公司,美国)。

    1.2 方法

    1.2.1 原代细胞培养 术前培养瓶包被多聚L赖氨酸[7]，将新生SD大鼠拉颈处死，取双侧大腿肌肉，去脂肪、血液、结缔组织，剪碎至1 mm3。

    1.2.1.1 组织块培养 将碎块移入培养瓶，0.3 cm间距，翻转放置37 ℃、5%CO2培养箱培养3～5 h；从无细胞面加入15%胎牛血清培养基，再翻转，放置37 ℃、5%CO2培养箱培养，每天换液[8]；约3 d，细胞覆盖瓶壁70%以上，传代。

    1.2.1.2 单层细胞培养 将碎块移入小烧瓶，加入0.25%胰蛋白酶，放置37 ℃水浴杯20 min；加入15%胎牛血清培养基，1 000 r/min(离心半径20 cm)，离心10 min，吸出上清液；上述重复2～3次，集合上清液依次滤过100目、200目筛网 ......