徐伟华，赵 冬，戴 晶，刘 祺，许 晖，黄啸元，王业忠

    ·论著·

    神经元特异性烯醇化酶在神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的表达变化

    徐伟华，赵 冬，戴 晶，刘 祺，许 晖，黄啸元，王业忠

    目的 探讨神经元特异性烯醇化酶(NSE)在体外培养神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的水平变化。方法 体外原代培养24 h内的新生SD大鼠海马区神经元，应用免疫荧光染色及电子显微镜鉴定神经元，应用体外氧糖剥夺建立大鼠海马区神经元缺血低氧损伤模型，分别对复氧1、6、12、24、48、72 h神经元提取蛋白质，Western blotting法检测不同时间点神经元损伤模型中NSE表达水平。结果 培养第4天的细胞免疫荧光染色显示神经元细胞核染色清晰，形态典型，突起走形如网状，阳性率为(93.6±1.6)%。各组NSE蛋白表达比较，差异有统计学意义(F=500.75，P1 材料与方法

    1.1 实验动物 选取新生24 h内SD大鼠3～4只，雌雄不限，SPF级，由新疆医科大学实验动物中心提供。

    1.2 主要化学试剂 DMEM/F12(Hyclone公司)，Neurobasal A medium(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，B-27添加剂(Gibco公司)，左旋多聚赖氨酸(PLL，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amerisco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone公司)，10 000 U/ml青霉素、10 000 U/ml链霉素和L-谷氨酰胺(Gibco公司)，NSE多克隆抗体(Gibco公司)，无血清培养基：Neurobasal培养基+2% B-27添加剂(50×)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+双抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)，于冰箱4 ℃保存备用；多聚-L-赖氨酸包被液：采用PBS配制1 mg/ml多聚-L-赖氨酸溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，4 ℃保存备用。

    1.3 大鼠大脑皮质神经元的分离及培养 取SD大鼠，常规碘伏消毒3遍后，75%乙醇消毒3遍，无菌条件下持眼科剪沿正中线剪开头皮与颅骨，暴露两侧大脑半球，用眼科无齿镊迅速取出整个脑组织，放入冰上盛有PBS的玻璃培养皿中，仔细剥离脑组织表面血管及脑膜，去除小脑、脑干，分离大脑皮质，PBS清洗2～3遍(去除红细胞)后，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，以0.25%胰蛋白酶在37 ℃ 5%CO2培养箱中消化10～15 min(其间振荡3次)，加入种植培养基(90% DMEM-F12+10% FBS)终止消化3～5 min ......